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背景:肺癌是我国乃至全球最常见的恶性肿瘤,其发病率及死亡率均居榜首[1]。随着医学事业的发展,对于肺癌的治疗,除了手术、化疗、放疗等传统治疗手段外,逐渐兴起了靶向治疗,使治疗更加个体化,检测个体的突变基因成为了必要[2]。研究发现30%的肺癌中存在致癌基因KRAS的表达,而且主要存在于非小细胞肺癌(non-small cell cancer,NSCLC)中,是重要的原癌基因之一,与肿瘤的生长、增殖及血管生成密切相关,且是不良的预后因素[3-6]。KRAS基因编码的蛋白,与G蛋白的功能相似,具有与鸟苷酸结合的能力,当其与三磷酸鸟苷(Guanosine triphosphate,GTP)结合后,可与多种效应分子如促有丝分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-actived Protein Kinases,MAPK),信号传导与转录激活因子(Signal transducers and act ivators of transcription,STAT)和磷酸肌醇3激酶(Phosphotylinosital 3 kinase,PI3K)等发生作用,从而调节细胞的生长、增殖与凋亡[7,8]。以上述信号通路为靶点的研究很多,但目前为止,并未发现有效的治疗靶点。正常分化的细胞主要依赖于线粒体的氧化磷酸化生成所需的能量,而大部分肿瘤细胞,不是靠有氧氧化,是以有氧糖酵解为其主要产能方式,这种现象称为“Warburg效应”,即在有氧条件下,恶性肿瘤细胞表现出高效摄取葡萄糖,并产生大量乳酸[9,10]。2011年Douglas Hanahan等在Cell杂志上发表综述,将能量代谢异常作为肿瘤细胞的标志之一[11]。该特性能够促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及参与介导耐药。然而Warburg效应的确切分子机制尚不清楚,越来越多的证据表明,该效应与癌基因有很大的关系,如Ras、src、myc、p53等[12,13]。近年来,在结肠癌细胞、胰腺癌细胞等其他肿瘤性疾病中发现KRAS通过调控糖酵解途径促使肿瘤的生长以及增殖[14-17],研究表明KRAS可通过调节缺氧诱导因子-1(Hypoxia inducible factor-1,HIF-1)、雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,m TOR)、p21活化激酶1(P21-activated kinase1,Pak1)等通路调节糖酵解途径[18-20]。在肺癌领域,KRAS与糖酵解的研究甚少,且KRAS调控糖酵解途径的机制尚未完全明了。目的:本实验目的是了解kras基因对肺癌细胞中糖酵解途径的影响。首先观察非小细胞肺癌细胞中kras、己糖激酶-2(hexokinase-2,hk-2)、丙酮酸激酶m2型(pyruvatekinasem2)的表达情况及乳酸生成量,通过敲降或上调kras表达水平,检测hk2、pkm2的表达情况及乳酸生成量。通过以上研究,以证明kras对肺癌细胞糖酵解途径的影响及其机制。方法和结果:第一部分:kras以及糖酵解关键酶在三种肺癌细胞株中的表达水平本研究收集h1299、a549、spc-a1细胞的rna、总蛋白以及培养基中的上清液,通过qrt-pcr、westernblot方法测定三种肺癌细胞的kras、hk2、pkm2,同时检测乳酸生成情况。1.在三种肺细胞中,qrt-pcr、westernblot结果显示h1299细胞的kras表达量最高,差异有统计学意义(p<0.05)。2.在三种肺癌细胞中,qrt-pcr、westernblot结果显示h1299细胞的hk2、pkm2表达量最高,差异有统计学意义(p<0.05)。3.在三种肺癌细胞中,乳酸浓度检测显示h1299细胞上清液中乳酸浓度最高,差异有统计学意义(p<0.05)。第二部分:kras表达对肺癌细胞糖酵解关键酶hk2、pkm2的影响将上述三种肺癌细胞中kras表达量最高的细胞株h1299予以慢病毒干扰,并检测其干扰效率。将细胞分组为:空白对照组(con组)、阴性序列对照组(nc组)、有效序列干扰组(kd组),采用qrt-pcr、westernblot检测kd组细胞中hk2、pkm2的表达量较前明显降低,乳酸生成量也较前明显降低。tnf-α作用于nc组及kd组细胞,再次用qrt-pcr、westernblot检测细胞中kras、hk2、pkm2的表达水平以及乳酸生成量,与nc组比较,tnf-α作用后,kras、hk2、pkm2表达量较前升高,乳酸生成量也较前升高。1.将三种针对kras基因的干扰序列以及阴性对照序列分别感染h1299细胞,检测发现kras-rnai(10300-1)该干扰序列较其余两组序列及阴性对照组有显著下降,差异有统计学意义(p<0.05),并将该组干扰序列成功构建稳定细胞株以备后续实验。2.敲降KRAS后,qRT-PCR、Western blot检测KD组细胞中的HK2、PKM2表达,与CON及NC组比较,敲降后H1299细胞中HK2、PKM2表达水平较前明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3.敲降KRAS后,乳酸浓度检测显示,与CON及NC组比较,敲降后H1299细胞的乳酸生成量减少,差异有统计学意义(P<0.05)。4.不同浓度TNF-α作用于H1299细胞,Western blot结果显示以浓度20ng/mlTNF-α作用H1299细胞后,KRAS蛋白表达最高。5.以20ng/ml TNF-α作用NC组及KD组细胞后,采用qRT-PCR、Western blot检测显示细胞中KRAS、HK2、PKM2均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。6.以20ng/ml TNF-α作用NC组及KD组细胞后,乳酸浓度检测显示作用后细胞上清液中乳酸浓度较前升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.在三种肺癌细胞中,KRAS表达量与糖酵解关键酶HK2、PKM2表达量相关。2.KRAS表达水平对乳酸分泌有影响,提示KRAS参与了肺癌细胞中糖酵解途径。3.KRAS通过调节糖酵解关键酶HK2、PKM2,影响糖酵解途径。