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本研究在滇西北横断山区发现虫草属一新种——横断山虫草,同时确认横断山虫草无性型为被毛孢属一新种——横断山被毛孢。横断山虫草是横断山被毛孢侵染鸣鸣蝉后形成的虫菌复合体,是虫与菌长期协同进化的产物。采用居群生物学研究方法,结合多层次研究手段开展对横断山虫草形态、显微结构、超显微结构和遗传结构以及化学成分多层次分析,得出以下结论:
1横断山虫草居群分布于金沙江和澜沧江流域海拔1900～3200米范围的云南松和云南松高山栎混交林下腐殖土层内,位于土表5～10cm处。寄主是同翅目蝉科鸣鸣蝉Oncotympana maculatieollis Motsch的若虫。虫体大小一般为40～50×15mm。寄主体表被白色菌丝层。子座多单生,少见2个及以上,圆棒状,子座从寄主前端发出,顶端会分叉(2～3个分叉),基部白色,上端和分叉为黑色,4.8～13.4±0.4～0.7cm。成熟时菌核表面呈淡黄色,2.3～3.8×0.9～1.2cm。可孕部位稍膨大,圆柱形或不规则(见图3.1)。子囊壳垂直埋生,长卵圆形,670.0～449.4±348.1～207.1μm;子囊帽锥形,高6.9～5.9μm,宽5.4～3.5μm;子囊长柱形,280.2～140.9×7.5～5.2μm;子囊孢子长柱状,221.7～111.4×2.8～2.1μm,具分隔,成熟后断裂为次生子囊孢子,长5.7～3.4μm。
横断山虫草与5种近缘种在形态上差异较小,但子座、子囊壳、子囊及子囊孢子的形态仍有明显的区别。ITS序列分析表明,ITS一级结构(GC含量和碱基长度)和酶切位点分布以及利用ITS1区对横断山虫草及其近缘种构建的系统进化树,均可将横断山虫草与其近缘种很好的区分开。
横断山虫草的无性型菌株为被毛孢属一新种——横断山被毛孢。横断山被毛孢的菌落形态、产孢方式、孢子大小等特征与被毛孢属已知种检索表相比下几点区别:(1)产孢方式有两种,菌丝一侧直接产生单瓶梗,产单孢子最常见;菌丝顶端产生较大的孢子。(2)产生的孢子形状不一,可明显为区别大、小分生孢子(大分生孢子18.0～29.3×4.7～5.6μm,小分生孢子2.8～3.7×2.2～2.9μm)。孢子外具不同程度的粘液层,孢子会粘成不同形状的孢子球。
DALP和EST-SSR分子标记聚类以及ITS克隆测序分析发现,横断山被毛孢为横断山虫草的无性型,而拟青霉一种为横断山虫草的伴生菌或杂菌。
2横断山虫草遗传多样性丰富,多态性突出,居群间分化剧烈。横断山虫草居群间菌核和子座形态表型分化系数(Vst)高达14.63％。DALP标记分析表明,横断山虫草居群多态位点百分比(PPB)在30.61%～55.10%之间,居群水平PPB平均值为47.87%,物种水平PPB值为87.07%;横断山虫草居群间基因分化系数(Gst)高达45.82%,横断山被毛孢居群间Gst高达33.07%。EST-SSR标记分析显示,横断山虫草居群间Gst高达58.81%,横断山被毛孢居群间Gst高达60.83%。横断山虫草菌核与子座居群间多糖、虫草酸、总甾体、总多酚化学成分分化系数(Cst)分别为8.30%和27.40%。横断山虫草菌核与子座居群间虫草素、腺苷、尿苷、鸟苷、尿嘧啶、腺嘌呤Cst分别为33.88%和46.26%。横断山被毛孢居群间多糖、虫草酸、总甾体、总多酚、虫草素、腺苷Cst为21.80%。研究表明,作用于横断山虫草居群形态、DNA分子、化学成分的选择压力各不相同;横断山虫草和横断山被毛孢菌丝体化学成分,其居群间分化系数(Cst)变异均较大,表明环境饰变作用也较大。
研究认为,横断山虫草遗传多样性丰富,多态性突出,居群间分化剧烈,其原因一是,横断山虫草居群间有高山深谷的地理隔离,横断山虫草有性孢子传播受阻,居群间基因交流也受阻;二是,过度采挖导致居群数量急剧减少,遗传漂变加剧;三是,横断山虫草栖息生态环境破坏越来越严重,生境片段化加剧。
3对横断山虫草ITS序列分析表明,横断山虫草5.8S(GC%=47.77%)为AT偏向性,而ITS序列中ITS1(GC%=54.37%)与ITS2(GC%=65.32%)为GC偏向性,可认为ITS1和ITS2与5.8S区域碱基偏向性的不同是由局部偏向性突变(RMB模型)造成的。横断山虫草ITS1长度为167～168bp,5.8S长度为157bp,ITS2长度为157bp。ITS1和ITS2区域有着特征性的酶切位点分布及其二级结构。ITS1和ITS2变异程度较大,而5.8S相对保守。利用ITS一级结构(GC含量和碱基长度)信息和酶切位点分布以及利用ITS1区对横断山虫草及其近缘种构建的系统进化树,将横断山虫草与其近缘种很好的区分开。
4滇西北横断山区复杂独特的地形地貌和气候条件形成该地区丰富多样的土壤和植被条件,从而为横断山虫草的生长与分布提供适宜的生境;横断山虫草是横断山被毛孢侵染鸣鸣蝉后形成的虫菌复合体。研究推测,横断山虫草是被毛孢菌株在第四纪冰川大幅萎缩后,由高海拔地区向低海拔辐射适应的中间过渡类型,因此,横断山虫草是滇西北横断山区独特地形、地貌、气候、植被的生境下进化产物,是真菌横断山被毛孢与寄主鸣鸣蝉协同进化的产物,是横断山造山运动中高山虫草物种从海拔高度向下辐射适应而进化产生的新物种。
5研究横断山虫草生活史发现,横断山被毛孢生活史中可以产生厚垣孢子。厚垣孢子为真菌无性世代循环中对营养缺乏等逆境的应答。
综上所述,从对横断山虫草居群菌核和子座形态、子囊壳和子囊结构、子囊孢子及菌丝形态、DALP和EST-SSR分子标记、ITS序列克隆测序、化学成分等多层次的变异式样分析,横断山虫草遗传多样性丰富,多态性突出,居群间分化剧烈。横断山虫草居群生境复杂多样,大规模的破坏性采挖,生境的片段化,导致横断山虫草居群数量急剧减少,从而加剧了横断山虫草居群间的分化。鉴于上述情况,建议采取原位保护措施,保护原生境,建立虫草自然保护区。同时,选育活性成分含量高的无性系菌株,培养生产符合人类需要的野生虫草替代品,也是保护和利用虫草生物资源的积极有效的办法。