肿瘤的发生、发展和转移离不开肿瘤血管生成，血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)在肿瘤血管生成中处于核心地位。VEGF的特异性受体fms-样酪氨酸激酶-1(fms-liketyrosinekinase-1，Flt-1)和含激酶插入区受体(kinaseinsertdomaincontainingreceptor，KDR)特异性地与VEGF结合而发挥促血管生成和促肿瘤侵袭、转移的作用。VEGF及其受体Flt-1、KDR在多种人体肿瘤中广泛表达，与肿瘤的临床分期、转移和预后不佳相关。 当前，分子靶向治疗是肿瘤治疗的热点。分子靶向治疗将抗癌药物定位到肿瘤细胞的基因或基因表达产物上，抑制肿瘤细胞的生长、增殖，最终致其死亡。与传统的细胞毒抗癌药物相比，分子靶向药物选择性高，对正常细胞损伤小；不会产生明显的骨髓抑制、消化道反应等毒副作用。肿瘤血管生成贯穿肿瘤的发生、发展和转移的全过程，VEGF在肿瘤血管生成中发挥关键作用，是分子靶向治疗的良好靶点。 自杀基因系统采用先导入基因，后给予前体药物的两步治疗方式使得该系统具有一定的可调控性及靶向性，在抗肿瘤治疗中有着广泛的应用前景。自杀基因系统的肿瘤杀伤作用在多个动物实验中得到证实，现已在视网膜母细胞瘤、前列腺癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤等肿瘤中进行了Ⅰ～Ⅱ期临床实验，证明其在人体实验中使用安全，有一定疗效。HSV-TK/GCV已被美国NIH批准应用于脑瘤的治疗。 第一部分VEGF及其受体Flt-1、KDR在鼻咽癌中的表达及意义目的：VEGF及其受体Flt-1、KDR在肿瘤血管生成及肿瘤进展中发挥关键作用。本研究探讨鼻咽癌组织中VEGF、Flt-1和KDR的表达与鼻咽癌患者的临床特征及预后的关系。 方法：1.本研究收集了1988年6月至1998年7月在中山大学肿瘤防治中心行鼻咽活检的鼻咽癌初诊患者鼻咽石蜡标本127例，具有完整存档病历及随访资料。所有患者初诊时经病理组织学检查确诊为低分化鳞状细胞癌(我国1991鼻咽癌诊治规范)或分化型非角化性癌(WHOⅡ型，WHO分类)。2.用免疫组织化学的方法检测127例鼻咽癌患者石蜡切片中VEGF、Flt-1和KDR的表达情况。3.用统计学软件SPSS10.0分析这三种蛋白表达的相关性、与临床特征的联系以及对患者总生存、无病生存和无进展生存的影响。 结果：在127例鼻咽癌组织中VEGF的阳性率为66.9％(85/127)，阳性表达部位在肿瘤细胞浆，胞膜也有轻度染色。Flt-1的阳性率为90.6％(115/127)，KDR的阳性率为88.2％(112/127)；Flt-1与KDR的阳性表达部位主要在肿瘤细胞浆和细胞膜，少量表达于间质血管内皮细胞。VEGF、Flt-1与KDR在坏死组织周围和癌巢边缘的表达明显增强，并且在癌细胞向间质浸润最明显处表达最强。鼻咽癌组织中VEGF表达与Flt-1和KDR表达呈正相关(r=0.292，P=0.001；r=0.287，P=0.001)，Flt-1表达与KDR表达呈正相关(r=0.723，P＜0.001)。 第二部分Avastin和自杀基因治疗鼻咽癌的体外实验研究目的：通过体外实验初步探讨重组人VEGF单克隆抗体Avastin和Ad-TK/GCV自杀基因系统在鼻咽癌治疗中的价值。 方法：采用MTT法检测Avastin和Ad-TK/GCV自杀基因系统对鼻咽癌CNE1细胞的抑制作用，采用流式细胞仪分析和Hoechst33342染色法探讨其作用机制。 结果：鼻咽癌CNE1细胞向培养上清液中分泌VEGF；Avastin对CNE1细胞无直接作用。通过对绿色荧光蛋白的检测，携带有TK基因的重组腺病毒可以100％感染CNE1细胞；随着Ad-TK自杀基因感染复数和前体药物浓度的增加，Ad-TK/GCV自杀基因系统对CNE1的杀伤作用逐渐增强，m.o.i为50时，仅有约20％的细胞存活，GCV浓度为0.5μg/ml时即接近其最大杀伤力；Ad-TK/GCV自杀基因系统对CNE1存在一定的旁杀伤效应。GCV作用后死亡细胞的比率分别为：Ad-LacZ(GCV0.1ug/ml)：1.28％，Ad-LacZ(GCV0.3ug/ml)：1.73％，Ad-TK(GCV0.1ug/ml)：8.51％，Ad-TK(GCV0.3ug/ml)：64.7％；Ad-TK组与对照组相比，死亡细胞的比率差异有显著性(P＜0.05)；凋亡细胞比率为：Ad-LacZ2.2％，Ad-TK12.7％。Ad-TK组与对照组相比，凋亡细胞的比率差异有显著性(P＜0.05)。 结论：鼻咽癌CNE1细胞可分泌VEGF；Avastin对体外培养的CNE1细胞无直接作用。Ad-TK/GCV自杀基因系统对CNE1细胞增殖的抑制作用随着感染复数和前体药物浓度的增加而增加，旁观者效应的存在增强了这种抑制作用。Ad-TK/GCV系统通过引起细胞坏死和细胞凋亡杀伤靶细胞。 第三部分Avastin联合Ad-TK自杀基因对鼻咽癌荷瘤裸鼠移植瘤生长作用的实验研究目的：探讨Avastin和Ad-TK/GCV自杀基因系统对鼻咽癌荷瘤裸鼠移植瘤的治疗价值。 方法：建立鼻咽癌CNE1细胞荷瘤裸鼠移植瘤模型，待肿瘤长至6mm左右时分组予以PBS、Avastin、Ad-TK/GCV、Ad-Lac-Z/GCV和Ad-TK/GCV+Avastin。计算肿瘤体积，描绘肿瘤生长曲线。停药2天后，处死裸鼠，取瘤组织称重，计算各组的抑瘤率。肿瘤组织行HE染色，光镜下观察组织病理学改变。 结果：PBS对照组和Ad-Lac-Z/GCV组肿瘤生长迅速，Ad-Lac-Z/GCV组与PBS组相比，无显著性差异(P＞0.05)；Avastin组、Ad-TK/GCV组和Ad-TK/GCV+Avastin组肿瘤增长缓慢，三组分别从治疗d10、d7、d3与PBS组相比，肿瘤体积有显著性差异(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)。从治疗后裸鼠肿瘤体积的生长曲线看，在各个时间点上联合用药组肿瘤的平均体积均低于Avastin组和Ad-TK/GCV组。治疗结束时，Ad-TK/GCV+Avastin组与Avastin组相比，肿瘤体积有显著性差异(P=0.013)，Ad-TK/GCV+Avastin组与TK组相比，肿瘤体积无显著性差异(P=0.474)；Avastin组与TK组相比，肿瘤体积无显著性差异(P=0.222)。治疗结束后Avastin组、Ad-TK/GCV组、Ad-Lac-Z/GCV组和Ad-TK/GCV+Avastin组的抑瘤率分别为55.7％、70.4％、-4.9％和85.7％。Ad-Lac-Z/GCV组与PBS组相比，平均瘤重的差别无显著性差异(P＞0.05)；Avastin组、Ad-TK/GCV组和Ad-TK/GCV+Avastin组与PBS组相比，平均瘤重的差别皆有显著性(P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001)。Ad-TK/GCV+Avastin组与Avastin组相比，瘤重有显著性差异(P=0.001)，Ad-TK/GCV+Avastin组与TK组相比，瘤重无显著性差异(P=0.093)；Avastin组与TK组相比，瘤重无显著性差异(P=0.125)。光镜下PBS对照组与Ad-Lac-Z/GCV组肿瘤细胞排列紧密，异型性明显，可见核分裂相；Ad-TK/GCV组、Ad-TK/GCV+Avastin联合治疗组可见肿瘤呈片状坏死。经PBS与Ad-Lac-Z/GCV处理的鼻咽癌移植瘤边缘血管生成丰富，而经Aastin治疗的鼻咽癌移植瘤边缘血管生成明显减少。 结论：Avastin及Ad-TK/GCV自杀基因系统对鼻咽癌CNE1细胞荷瘤裸鼠移植瘤的生长有一定的抑制作用。两种治疗联合产生协同作用，其疗效优于单用Avastin；但与单用Ad-TK/GCV自杀基因相比，疗效差异未达到统计学显著性，有待扩大样本量进一步研究。 结论 1.VEGF、Flt-1和KDR在鼻咽癌组织中高表达；VEGF表达与Flt-1和KDR表达呈正相关，Flt-1表达与KDR表达呈正相关。VEGF蛋白的表达与原发肿瘤的侵犯范围、淋巴结转移、临床分期相关，KDR蛋白表达也与原发肿瘤的侵犯范围相关；三种蛋白表达与肿瘤局部复发、远处转移相关。 2.三种蛋白表达与总生存、无病生存和无进展生存时间呈负相关。Cox多因素相关分析显示年龄＞50岁和VEGF阳性为独立的不良预后因素。 3.鼻咽癌CNE1细胞可分泌VEGF；Avastin对体外培养的CNE1细胞无直接作用。Ad-TK/GCV自杀基因系统对CNE1细胞增殖的抑制作用随着感染复数和前体药物浓度的增加而增加，旁观者效应的存在增强了这种抑制作用。 4.Ad-TK/GCV系统通过引起细胞坏死和细胞凋亡杀伤靶细胞。 5.Avastin及Ad-TK/GCV自杀基因系统对鼻咽癌CNE1细胞荷瘤裸鼠移植瘤的生长有一定的抑制作用。两种治疗联合产生协同作用，其疗效优于单用Avastin；但与单用Ad-TK/GCV自杀基因相比，疗效差异未达到统计学显著性。