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乙型脑炎(Japanese encephalitis),简称乙脑,是由黄病毒科黄病毒属成员乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染所引起的一种危害严重的虫媒性人畜共患病。该病感染人后,多表现为发热、恶心、意识障碍等,造成患者死亡或是留下较严重的神经系统后遗症;感染猪群后,则表现为明显的生殖障碍,造成重大经济损失。但长期以来,乙型脑炎病毒非结构蛋白的功能及其在乙脑致病过程中的作用尚不明确。为此,本研究制备、筛选了抗JEV NS2B蛋白单克隆抗体,并利用该抗体,研究了JEV强弱毒株NS2B蛋白在不同细胞系、不同时间点的表达分布情况,以期为揭示JEV NS2B蛋白的功能开辟新思路。具体研究结果如下:1.JEV NS2B蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的初步鉴定。利用原核表达的GST-NS2B蛋白免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和间接酶联免疫试验(ELISA)筛选杂交瘤细胞株,得到3株可稳定分泌抗NS2B蛋白的特异性单克隆抗体细胞株,分别命名为:1B9、3E12、4E6。Ig亚型分别为:Ig G2b、Ig G1、Ig G1。轻链均为Kappa链。经间接ELISA、间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western blot)检测,这3株单抗均具有较好的特异性和敏感性。在此基础上,通过构建JEV NS2B原核分段表达质粒p GEX-KG-NS2B-1(1-201bp)和p GEX-KG-NS2B-2(190-393bp),得到有4个氨基酸重叠的NS2B截短突变体蛋白,GST-NS2B-1(1-67aa)和GST-NS2B-2(64-131aa)。经过间接ELISA和Western blot检测,发现上述3株单克隆抗体所识别的抗原表位均位于JEV NS2B蛋白的第68-131位氨基酸。2.JEV强弱毒株NS2B蛋白表达分布比较不同细胞系在感染相同MOI的JEV P3株和SA14-14-2株后,在不同时间点收取细胞样品,分别提取病毒样品、RNA样品和蛋白样品。比较两毒株间在增殖滴度、m RNA水平的差异,并利用所制备的单克隆抗体,比较JEV感染BHK-21和SK细胞后,NS2B及E蛋白在不同时间点蛋白表达水平上的差异。结果发现:在SK细胞中,SA14-14-2弱毒株增殖滴度显著高于P3强毒株;但在复制水平上,在两个细胞系中,P3强毒株均显著高于SA14-14-2弱毒株;SA14-14-2弱毒株的E蛋白表达水平高于P3强毒株,但NS2B蛋白的表达情况则相反。