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研究背景类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是以滑膜异常增生为病理特点的一种自身免疫病。RA是一种难治性疾病,无论是使疾病完全缓解、基本缓解、还是减轻疾病的活动程度,均需要长期用药。但至今尚未发现一种药物（包括甲氨喋呤、金制剂等疾病控制药物）能够完全控制病情。国内外研究者试图以各种联合用药方案来控制病情发展,曾有过“金字塔”方案,采用所谓上台阶式,即先用消炎止痛药,半年后无效再逐一增加改变病情的抗风湿药,如金制剂、青霉胺,无效再加细胞毒药物,最后用激素。但这种方式的最大缺点是使用消炎止痛药半年无效,骨质已被破坏,再用改变病情药物,对已存在的关节破坏无法恢复。另一种是下台阶模式,即先联合用药,以后逐渐减停,最后仅留一两种副作用最小的药物维持,但是究竟那种方案才是最好的选择,联合用药后的远期疗效如何,尚无人能肯定做出答复。并且无论哪种用药方式均无法避免病情控制药物的非特异性抑制全身免疫系统所带来的副作用。生物制剂目前已经开始在国内逐步广泛应用,国内外均有其关于迅速抑制炎症和改善RA骨质破坏的报道,但因其长期疗效观察的研究较少,增加意料之外的感染风险,价格昂贵,而限制了其临床的广泛应用。目前对RA发病机制的研究主要集中在抗原模糊识别研究方面,针对其发病机制,如果能抑制T细胞针对自身抗原的免疫反应,恢复机体对暴露的自身抗原耐受,有利于治疗自身免疫疾病。口服耐受（Oral tolerance,OT）指口服引起自身免疫病的蛋白类自身抗原,诱导相关免疫细胞和细胞因子活化,抑制体内针对自身抗原的免疫反应,达到治疗自身免疫疾病的目的。这一安全有效方便的治疗方法逐渐受到国内外学者的重视。因此近20年来,OT已经成为免疫治疗中的一个热点。OT的基本机制涉及主动抑制（active suppression）、旁路抑制（bystander suppression）、克隆缺失（clonaldeletion）、克隆无能（clonal anergy）、TGF-β等抑制性炎症因子的分泌以及Th1细胞因子和Th2细胞因子之间的平衡。哪种方式在口服耐受中起支配作用在很大程度上取决于口服抗原的剂量和种类以及自身的免疫状态。低剂量介导主动抑制和旁路抑制,而高剂量介导克隆无能或缺失。近年来,口服免疫耐受已成为黏膜免疫的研究热点,并广泛用于变态反应性脑脊髓膜炎、RA、Ⅰ型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、实验性自身免疫性重症肌无力等自身免疫疾病的研究当中。国内外均有关于口服抗原治疗自身免疫疾病的临床和基础实验报道。Ⅱ型胶原蛋白（typeⅡcollagen,CⅡ）是人和动物关节中含量最丰富的蛋白之一,被认为最有可能是RA的自身抗原。各物种的胶原蛋白具有高度同源性,90%左右的氨基酸序列相同。目前国内外均有通过口服CⅡ诱导免疫耐受治疗RA动物模型的研究报道,该方法简便、安全、有效,是目前研究的热点。乌梢蛇是治疗关节疼痛的常用中药,乌梢蛇水煎液主要成分分析显示其含有大量的胶原物质。佐剂诱导型关节炎（adiuvant arthritis,AA）在临床表现、病理学、免疫学改变和病理机制等方面与人RA有许多相似特征,目前较为广泛和成熟的应用于RA的临床和基础研究中。提取乌梢蛇有效成分,并对其AA大鼠的干预作用机制进行初步研究,有助于我们认识乌梢蛇治疗RA的机制。目的1提取和纯化乌梢蛇CⅡ2通过观察乌梢蛇CⅡ对佐剂诱导型关节炎模型的干预作用的研究,对其作用机制进行初步探索。方法1乌梢蛇CⅡ的提取和鉴定1.1采取限制性胃蛋白酶降解法提取乌梢蛇CⅡ;1.2SDS-PAGE凝胶电泳测定提取乌梢蛇CⅡ的蛋白分子量;1.3紫外分光光度计测定提取乌梢蛇CⅡ的紫外吸收波长;1.4western-blot方法鉴定提取的乌梢蛇CⅡ;2乌梢蛇CⅡ对AA大鼠的干预作用的研究2.1采用完全弗氏佐剂（complete Freud’s adjuvant,CFA）0.1ml足垫皮下注射诱导AA大鼠模型;2.2实验分组:乌梢蛇CⅡ体外直接作用浓度方案:空白对照组（Control）、乌梢蛇CⅡ低剂量组（low doses,LD）、乌梢蛇CⅡ中剂量组（middle doses,MD）、乌梢蛇CⅡ高剂量组（high doses,HD）分别为CⅡ0μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml;灌服乌梢蛇CⅡ浓度方案:乌梢蛇CⅡ低剂量组（low doses,LD）、乌梢蛇CⅡ中剂量组（middle doses,MD）、乌梢蛇CⅡ高剂量组（high doses,HD）、分别灌服CⅡ5μg/kg、50μg/kg、500μg/kg;正常大鼠组、AA模型组灌服0.01 mol/L的冰醋酸（即CⅡ的溶剂）;2.3分别以高、中、低剂量CⅡ灌服SD大鼠模型,并设空白对照组和AA模型组:造模后16天、20天、24天、28天观察肿胀关节,造模后28天分离滑膜、切片HE染色,观察滑膜炎症;2.4L929细胞毒性法检测TNF-α细胞毒活性,MTT法检测IL-1β细胞增殖活性;2.5ELISA法检测血清和滑膜细胞上清液的细胞因子水平;3统计学处理:结果均用mean±SD表示,采用SPSS13.0软件进行分析,关节肿胀度评分采用重复测量方差分析方法进行统计,多组间比较采用one-wayANOVA方差分析法,方差齐时,两组比较采用LSD检验,如多组与对照组比较使用Dnutte检验,当方差不齐时,采用Welch稳健估计,再采用T2方法两两比较,P＜0.05为有统计学意义结果1乌梢蛇CⅡ的鉴定1.1SDS-PAGE凝胶电泳测定的乌梢蛇CⅡ分子量约为118KD～120kD;1.2紫外分光光度计测定提取的CⅡ吸收峰约为230nm;1.3western-blot测定其显影带均与标准的牛鼻中隔CⅡ相符;2乌梢蛇CⅡ对AA大鼠的干预作用的研究2.1采用完全弗氏佐剂足厚挚下注射诱导佐剂型关节炎模型,至免疫后15d左右开始出现对侧关节肿胀,后肢、踝关节及足部小关节出现红肿,逐渐加重,严重者呈现消瘦、脱毛、尾部肿胀等全身表现。2.2灌服乌梢蛇CⅡ对AA大鼠关节肿胀程度的影响:造模后16、20天各组关节肿胀程度无显著性差异,造模后24天、28天,中、低剂量CⅡ组动物模型关节肿胀程度得到改善（P＜0.05）;2.3乌梢蛇CⅡ体外对AA大鼠滑膜细胞炎症因子活性的影响:乌梢蛇CⅡ各浓度组体外对AA大鼠滑膜细胞上清液TNF-α和IL-1β活性没有直接作用;2.4乌梢蛇CⅡ体外对AA大鼠滑膜细胞和肠集合淋巴小结（Peyer’s patch,PP）细胞共培体系的炎症因子活性的影响:乌梢蛇CⅡ中浓度组可抑制AA大鼠的滑膜细胞和PP共培体系上清液TNF-α和IL-1β活性（P＜0.01）,乌梢蛇CⅡ低、高浓度组可抑制AA大鼠的滑膜细胞和PP共培体系上清液IL-1β活性（P＜0.05）;2.5灌服乌梢蛇CⅡ对AA大鼠滑膜细胞炎症因子活性的影响:AA模型组与空白对照组相比,滑膜上清液TNF-α和IL-1β活性显著升高（P＜0.01）;灌服乌梢蛇CⅡ低、中剂量组与AA模型组相比,TNF-α活性下降（P＜0.05）;中剂量组与AA模型组相比,IL-1β活性下降（P＜0.05）;2.6灌服乌梢蛇CⅡ对AA大鼠滑膜细胞上清液炎症因子水平的影响:AA模型组与空白对照组相比,滑膜上清液TNF-α和IL-1β水平显著升高（P＜0.01）;乌梢蛇CⅡ中、高剂量作用组与AA模型组相比,均能抑制滑膜上清液TNF-α和IL-1β水平（P＜0.01）;乌梢蛇CⅡ低剂量组能显著抑制滑膜上清液IL-1β水平（P＜0.01）;乌梢蛇CⅡ中剂量组能显著升高滑膜上清液TGF-β（P＜0.01）:2.7灌服乌梢蛇CⅡ对AA大鼠血清炎症因子水平的影响:AA模型组与空白对照组相比,TNF-α浓度升高（P＜0.01）、IL-1β浓度显著升高（P＜0.01）;灌服乌梢蛇CⅡ中、高剂量组与AA模型组相比,TNF-α浓度下降（P＜0.01）;灌服乌梢蛇CⅡ各剂量组与AA模型组相比,IL-1β浓度显著下降（P＜0.01）;灌服乌梢蛇CⅡ中、高剂量组与AA模型组相比,TGF-β浓度上升（P＜0.01）;结论1采用限制性胃蛋白酶降解法提取乌梢蛇CⅡ,经SDS-PAGE凝胶电泳、紫外分光光度计法和western-blot法鉴定理化性质与标准的CⅡ一致,证明我们提取的为乌梢蛇CⅡ。2灌服乌梢蛇CⅡ能改善AA大鼠关节肿胀程度和滑膜炎症、乌梢蛇CⅡ体外对滑膜细胞炎症因子没有直接作用,乌梢蛇CⅡ体外作用于AA大鼠滑膜细胞和PP细胞共培体系和灌服乌梢蛇CⅡ均可以抑制滑膜细胞炎症因子的水平和活性,抑制血清TNF-α和IL-1β水平和升高血清TGF-β水平,提示乌梢蛇CⅡ是通过口服耐受机制对AA大鼠有明显的干预作用。