研究背景及意义结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤,在欧美等西方发达国家的发病率位居所有肿瘤第二位,并在发展中国家呈逐年上升的趋势；近二十年来,随着经济的发展,人们的生活方式、饮食结构的转变,全球范围内结直肠癌的发病率呈逐年上升的趋势,且发病年龄逐渐年轻化。2012年中国肿瘤登记年报的统计数据显示,2009年中国结直肠癌位居国内肿瘤发病率的第3位和死亡率的第5位,北京、上海等一线城市的结直肠癌发病率已经接近甚至高于发达国家水平。结直肠癌已经成为严重危害人们的身体健康、降低患者生活质量的常见病,同时也给社会与家庭带来沉重的经济负担。结直肠癌的发病机制与环境、遗传、疾病等多种因素有关,涉及多个癌基因的激活和抑癌基因的失活。目前通过早期筛查技术,能够发现一些早期结直肠癌患者,从而有效提高患者的存活率、降低病死率；另外各种新型化疗药物和分子靶向药物不断面世提高了临床疗效,然而晚期结直肠癌仍然所占比例较高、治疗效果差,5年生存率依然很低。因此寻找新的早期诊断标志物及新的治疗靶点,进而提高疗效改善预后具有重要临床价值和社会效益。沉默信息调节因子2(sir2)是最初在芽殖酵母中发现的一种抗衰老基因,其编码的小分子蛋白Sirt2具有NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶活性,与寿命延长相关。SIRT1是Sirt2在哺乳动物中同源性最高的一个类似物,它参与细胞的能量代谢、增殖衰老、炎性反应、神经保护、肿瘤形成等多个过程。SIRT1功能主要通过去乙酰化对基因表达起调节作用的关键蛋白来实现。SIRT1不仅可以去乙酰化酵母菌和哺乳动物中多种组蛋白特殊的赖氨酸残基,如H1(K26), H3(K9, K14), H4(K16)等,而且SIRT1还可以使一些非组蛋白去乙酰化。经典抑癌蛋白P53是SIRT1明确的下游蛋白,SIRT1能够通过去乙酰化对P53的活性和表达进行调控,从而参与由P53介导的细胞增殖与凋亡。超过50%的人类肿瘤中P53发生突变,突变P53由抑癌基因转变为促癌基因,SIRT1可能在P53发生突变过程中起到重要作用。在肿瘤发生、发展中发挥着重要的作用其他一些非组蛋白也可被SIRT1去乙酰化,例如HIF-1α、HIF-2α,β-catenin等；有报道SIRT1可以通过去乙酰化β-catenin,抑制结肠多发性息肉腺瘤的增殖。SIRT1在结直肠癌的作用机制以及亚细胞定位、亚细胞定位与核浆穿梭的关系尚有争议。有报道指出,磷酸化能够调控SIRT1的去乙酰化活性和核浆穿梭,有关SIRT1磷酸化作用在结直肠癌中的研究鲜见报道,因此我们在本实验研究的第一部分着重分析Phospho-SIRT1与SIRT1在结直肠癌中表达与定位,以及探讨SIRT1磷酸化在肿瘤形成中的作用。关于SIRT1、P53与β-catenin在结直肠癌中的表达与临床病理特征的关系,以及SIRT1与P53、β-catenin的相关性,本实验研究第二部分将予以探讨分析。第一部分SIRT1在结直肠癌中亚细胞定位及其磷酸化研究目的：本实验研究通过检测SIRT1、Phospho-SIRT1在结直肠癌组织和癌旁正常组织中的表达水平及亚细胞定位情况,以及SIRT1在结直肠癌组织和癌旁正常组织中的转录水平,分析Phospho-SIRT1与SIRT1之间的相关性,探讨磷酸化在结直肠癌中发挥的作用。方法：采用免疫组织化学方法和Western blot方法检测结直肠癌组织及癌旁正常组织中SIRT1和Phospho-SIRT1蛋白表达情况及亚细胞定位情况；采用Real-Time PCR方法检测结直肠癌组织和癌旁正常组织中SIRT1 mRNA水平。结果：1. SIRT1在癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05),SIRT1在结直肠癌组织和癌旁正常组织中均完全定位于细胞核内,无胞浆定位；2. Phospho-SIRT1在结直肠癌组织和癌旁正常组织中均完全定位于细胞核内,无胞浆定位；Phospho-SIRT1在癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05)。3. Phospho-SIRT1与SIRT1在结直肠癌组织和癌旁正常组织中的表达均呈正相关(r=0.8717,r=0.7354),Phospho-SIRT1/SIRT1比值在癌组织中高于癌旁正常组织。4. SIRT1在结直肠癌组织和癌旁正常组织中的转录水平无明显差异。结论：1. SIRT1、Phospho-SIRT1在结直肠癌组织中的表达均高于癌旁正常粘膜组织,推测SIRT1与Phospho-SIRT1在结直肠癌的形成过程中具有促癌作用。2. SIRT1与Phospho-SIRT1在结直肠癌组织和癌旁正常粘膜组织中只定位于细胞核内,无胞浆定位；提示Phospho-SIRT1并不代表SIRT1的核浆穿梭部分,可能在体内具有多种因素的复杂调控机制决定SIRT1的亚细胞定位。3. Phospho-SIRT1与SIRT1在结直肠癌组织和癌旁正常粘膜组织中的表达水平均呈正相关,而且Phospho-SIRT1在结直肠癌组织和癌旁正常组织中均定位于细胞核内,结直肠癌组织中Phospho-SIRT1/SIRT1的比值高于癌旁正常组织,推测Phospho-SIRT1可能决定了SIRT1在组织中的作用,SIRT1的磷酸化具有促癌作用。4.结直肠癌组织和癌旁正常组织中的SIRT1 mRNA表达水平无差异性,提示SIRT1蛋白表达水平与其mRNA转录水平无关,推测SIRT1基因表达受到显著的转录后调节。第二部分SIRT1、P53及β-catenin在结直肠癌中的表达及临床病理意义目的：本研究通过检测沉默信息调节因1 (SIRT1)在结直肠癌组织以及癌旁正常粘膜组织中的表达水平,SIRT1与P53、β-catenin在结直肠癌组织的表达相关性,探讨SIRT1在结直肠癌发生发展中的作用。方法：采用免疫组织化学化法检测76例结直肠癌组织中的SIRT1、P53及P-catenin的表达及30例癌旁正常粘膜组织中SIRT1表达水平,分析SIRT1在结直肠癌组织与癌旁正常组织表达差异性,分析三者与结直肠癌临床病理特征的关系以及SIRT1与P53、β-catenin表达相关性。结果：1. SIRT1在结直肠癌组织和癌旁正常组织中均完全定位于细胞核内,未见胞浆定位；2. SIRT1在结直肠癌组织和正常组织中的阳性表达率分别为64.47%(49/76)和36.67%(11/30)。SIRT1在癌组织和正常组织中的平均染色评分分别为4.667±0.374和2.650±0.425。经统计学分析显示,SIRT1在结直肠癌组织中的表达高于癌旁正常粘膜组织,差异具有统计学意义(P<0.05)；3. SIRT1的表达与结直肠癌浸润深度、分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关,且随着浸润深度加深、分化程度越低、合并淋巴结转移及临床分期升高时表达升高(P<0.05)。P53在结直肠癌组织中高表达与肿瘤浸润深度、合并淋巴结转移、TNM分期有关,P-catenin的高表达与肿瘤浸润深度、分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关(P<0.05)；4. SIRT1表达和P53的表达呈正相关(R=0.287,P=0.009)；SIRT1表达和B-catenin表达之间无明显相关性(R=0.213,P=0.058)。结论：1. SIRT1在结直肠癌组织中高表达,推测SIRT1在结直肠癌的形成过程中具有促癌作用。2. SIRT1、P53、β-catenin与结直肠癌的临床病理学特征的相关性,提示联合检测SIRT1、P53以及β-catenin的表达对判断患者预后具有一定的意义。3. SIRT1在结直肠癌组织中的阳性表达和P53的表达呈正相关(R=0.287,P=0.009),推测SIRT1可能是结直肠癌的一种促癌基因,其机制可能通过去乙酰化P53来调控P53活性和表达,从而抑制了P53介导的细胞凋亡从而参与了结直肠癌的进展。4. SIRT1在结直肠癌组织中的阳性表达和β-catenin之间无明显相关性(R=0.213,P=0.058),未能提示SIRT1通过去乙酰化β-catenin起到抑癌基因的作用。该结果可能与β-catenin细胞核、胞浆不同定位而作用不同有关。进一步研究β-catenin的亚细胞定位与SIRT1的相关性,可能有助于揭示二者之间的关系。