乳腺癌是严重危害女性生命健康的恶性肿瘤。近年来,越来越多的证据表明肿瘤中存在着一群比例较低的细胞,却可能与肿瘤的进展、耐药、复发和转移等关系密切,它们被命名为肿瘤干细胞。转录因子Nanog最初发现于胚胎干细胞中,它是维持胚胎干细胞自我更新和多能性的关键因子,是干细胞自我更新、增殖,同时保持其分化潜能所必需的。最新的研究表明,Nanog在包括乳腺癌在内的多种肿瘤中的表达水平明显升高,它在肿瘤的发生发展中起到了重要的调控作用,提示它可能成为一个潜在的治疗靶点。目前已知,Nanog在胚胎干细胞中的功能在于维持其自我更新和多向分化潜能,而在肿瘤干细胞,特别是乳腺癌干细胞中的表达特征及功能一直处于未知状态,尚未见文献报道。Nanog在乳腺癌干细胞中是否也具有其在胚胎干细胞中的相似功能?这已成为基于Nanog为靶点的乳腺癌干细胞靶向治疗研究进程中首先需要解答的问题。为此,本课题就转录因子Nanog基因在乳腺癌干细胞中的表达特征及其所具有的功能等问题进行了初步研究。目的:1.以乳腺癌细胞系为模型,建立以细胞表面标志物CD44+CD24-和悬浮微球体培养的乳腺癌干细胞分选、富集的方法,阐明转录因子Nanog基因及其不同转录本在乳腺癌干细胞中的表达特征;2.针对人Nanog基因序列,设计并构建Nanog-RNAi慢病毒载体,为后续基因功能研究奠定基础;3.分析转录因子Nanog在乳腺癌干细胞中所具有的功能,对以Nanog为靶点的乳腺癌干细胞靶向治疗进行初步探索。方法:1.Nanog在乳腺癌干细胞中的表达:1)以细胞表面标志物CD44+CD24-对乳腺癌细胞系进行FACS分选;2)体外无血清干细胞培养环境对乳腺癌细胞系进行悬浮微球体培养以富集乳腺癌干细胞;3)Western Blot和免疫荧光检测微球体和贴壁细胞中Nanog的表达差异及其细胞定位;4)Real-time PCR检测Nanog、Oct4、Sox2、Klf4、CD44、Wnt2、Notch1和ABCG2等干细胞相关基因在CD44+CD24-和non-CD44+CD24-细胞中的表达差异,以及Nanog三个不同转录本在CD44+CD24-细胞中的表达差异。2.Nanog-RNAi慢病毒载体的构建与鉴定:1)针对人Nanog基因的si RNA靶点设计4个靶序列,合成单链DNA oligo片段后,将单链DNA oligo的正义链和反义链混合物制备成双链DNA oligo;2)使用Age I和Eco R I限制性内切酶对慢病毒质粒p GC-LV载体进行双酶切后,与制备的双链DNA oligo连接,构成重组质粒,转化感受态细胞,对生成的阳性克隆进行PCR鉴定及测序;3)采用三质粒系统共转染293T细胞,收集细胞上清液浓缩并测定病毒滴度;4)用构建的Nanog-sh RNA慢病毒载体感染目的细胞,Real-time PCR进行内源性筛靶。3.Nanog在乳腺癌干细胞中的功能:1)CCK-8法和克隆形成实验用于评价sh Nanog-LV对乳腺癌细胞增殖的影响;2)微球体培养用于评价sh Nanog-LV对乳腺癌细胞微球体形成能力的影响;3)FACS分析用于评价sh Nanog-LV对乳腺癌细胞CD44+CD24-比例的影响;4)Real-time PCR用于检测sh Nanog-LV对乳腺癌细胞分化标志物和干细胞相关基因表达的影响。结果:1.Nanog在乳腺癌干细胞中的表达:1)不同分子分型的乳腺癌细胞系中CD44+CD24-细胞比例不同:MCF-7细胞中CD44+CD24-的比例为3.38±0.467%,SK-BR-3细胞中CD44+CD24-的比例为0.392±0.113%,MDA-MB-231细胞中CD44+CD24-的比例为89.5±2.13%;2)不同分子分型乳腺癌细胞系的微球体形成能力不同:MCF-7和SK-BR-3细胞可以在干细胞培养基中形成典型的微球体结构,MDA-MB-231细胞则不能;3)微球体细胞可以在体外进行传代培养,形成与亲代形态结构相似的微球体;4)Nanog在MCF-7细胞微球体中的表达水平高于贴壁细胞;5)MCF-7细胞中CD44+CD24-比non-CD44+CD24-亚群细胞具有更强的微球体形成能力;6)MCF-7细胞中CD44+CD24-比non-CD44+CD24-亚群细胞高表达Nanog、Oct4、Sox2、Klf4、CD44、Wnt2、Notch1和ABCG2等干细胞相关基因;7)Nanogp8在CD44+CD24-的MCF-7细胞中表达水平明显高于Nanog1和Nanog2;8)Nanog主要表达于MCF-7细胞的细胞核中,但细胞质也有一定程度的表达。2.Nanog-RNAi慢病毒载体的构建与鉴定:1)设计构建的重组Nanog-RNAi慢病毒质粒经PCR和测序验证,设计的sh Nanog序列成功插入;2)病毒滴度测定结果分别为4E+8、8E+8、1E+9和9E+8;3)Real-time PCR内源性筛靶确定LV-Nanog-RNAi(4515-1)对MCF-7细胞中Nanog基因表达的抑制率最高。3.Nanog在乳腺癌干细胞中的功能:1)构建的sh Nanog慢病毒载体可以有效抑制Nanog的表达水平;2)sh Nanog可以抑制乳腺癌细胞的增殖和克隆形成;3)sh Nanog可以抑制MCF-7细胞的微球体形成能力;4)sh Nanog可以减少乳腺癌细胞中CD44+CD24-的比例;5)sh Nanog可以上调乳腺癌细胞分化标志物CK14和CK18的表达水平,下调Oct4、Sox2、Klf4、CD44、Wnt2、Notch1和ABCG2等干细胞相关基因的表达水平。结论:1.Nanog在乳腺癌干细胞富集亚群中较非乳腺癌干细胞亚群中的表水平明显升高;2.设计并成功构建的Nanog-RNAi慢病毒载体对目的细胞中Nanog的表达具有明显的抑制效应,可用于后续的研究;3.sh Nanog慢病毒载体介导的Nanog基因沉默可以抑制乳腺癌细胞的增殖和克隆形成,以及抑制其肿瘤干细胞特征,包括抑制微球体形成、CD44+CD24-细胞比例、干细胞相关基因的表达和上调分化标志物的表达等。