系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE) (OMIM 152700)是一种典型的全身性自身免疫疾病,主要特征为患者体内可产生大量致病性的自身抗体,且免疫复合物沉积在关节、肝脏、肾小球、皮肤等部位,引起多器官多系统损伤,女性患病率明显高于男性。SLE临床表现复杂多样,发病原因复杂,是由环境因素、性激素和遗传因素共同作用而引起的。尽管关于SLE的研究在多方面取得了众多成果,但其具体发病机制尚未完全阐明。SLE患者自身免疫系统功能紊乱,产生的大量自身抗体及免疫复合物常累积在肾脏,最终导致肾功能衰竭,据流行病学统计数据显示约1/3的SLE患者患有肾小球肾炎。SLE患者体内多种免疫细胞均出现异常,已有研究显示B细胞和T细胞的异常活化与SLE的发病有关,此外,患者体内Th1、Th2和Th17各亚型T细胞数目、功能的异常以及CD4+/CD8+T细胞比例的失衡也是导致SLE发病的重要原因之一MicroRNA(miRNA)是近20年来发现的一类内源性的、重要的基因表达调控因子,参与调控众多生物学过程,比如细胞增殖、凋亡和分化等。目前已证实多种miRNA参与免疫细胞的发育及免疫应答过程,比如miR-181a、miR-146a及miR-155等。其中miR-155是近几年来在自身免疫病领域研究较多的miRNA分子。MiR-155定位于人染色体21q21.3,由一个非编码基因BIC (B cell integration cluster)编码,其前体位于BIC基因的第3外显子内。MiR-155的异常表达与多种免疫系统肿瘤的发生相关,已经证实BIC基因或者miR-155的过表达与弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤的发病相关。目前已证实其可以参与包括B细胞、辅助性T(Th)细胞、调节性T (Treg)细胞、树突状(DC)细胞以及滤泡辅助性T(Tfh)细胞等多种免疫细胞的发育及应答过程。此外miR-155的异常表达也与多种自身免疫病的发病相关,如类风湿性关节炎、多发性硬化症和系统性红斑狼疮。在类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)患者的滑膜和滑液巨噬细胞中可检测到miR-155和炎症相关因子表达升高,小鼠实验也证实miR-155-/-小鼠能明显抵制胶原诱导的关节炎。MiR-155-/-小鼠还可明显抵制实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)的发生,且miR-155-/-EAE小鼠脾脏和淋巴结中炎性细胞Thl和Thl7细胞的比例明显减少。此外,在SLE患者及多种狼疮样小鼠的各器官组织中均可检测到miR-155的异常表达。综上所述,miR-155可能在自身免疫疾病发病过程中发挥促炎作用。尽管关于miR-155与SLE的关系已有部分报道,但具体的机制并不清楚。为明确miR-155参与SLE发生发展的具体分子机制,我们采用小鼠模型,在狼疮小鼠体内缺失miR-155的表达并进一步观测小鼠狼疮表型是否得以缓解,并对miR-155是否存在其他的靶基因进行了深入的探究。第一部分 MiR-155-/-Faslpr/lpr小鼠的构建及表型分析MRL/lpr是目前世界上公认的研究SLE的小鼠模型,我们发现该狼疮小鼠的脾脏和胸腺中miR-155表达量明显高于野生型小鼠。为了在小鼠模型中明确miR-155在SLE发生发展中的作用,我们利用C57BL/6背景下的MRL/lpr小鼠(B6. MRL/lpr)与miR-155-/-小鼠杂交得到两个基因均为杂合子的Fl代,随即经过回交和互交的杂交策略,最终得到miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠以及同窝对照Faslpr/lpr小鼠。我们分别选取野生对照小鼠、Faslpr/lpr狼疮小鼠和miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠进行表型分析,在小鼠40-50周龄时将其处死,观察并记录小鼠的各项生理指标。脾脏重量及脾重/体重比是衡量狼疮小鼠表型严重程度的重要指标,于是我们首先对三组小鼠的脾重及脾重/体重比进行了检测,结果显示,与野生型小鼠相比,Faslpr/lpr狼疮小鼠脾肿大症状明显,而miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠脾肿大症状明显缓解,脾重/体重比也得以恢复。此外,由于狼疮小鼠体内产生的大量自身抗体及免疫复合物通常累积在肾脏,并最终诱发狼疮样肾炎,于是我们又对两组小鼠肾脏的损伤程度进行了检测。通过代谢笼收集不同年龄段小鼠24h的尿液,并利用考马斯亮蓝法检测两组小鼠蛋白尿含量,结果显示40-50周龄的miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠尿蛋白水平显著低于Faslpr/lpr狼疮小鼠,而30周龄时,两组小鼠的尿蛋白含量没有明显变化。病理组织学分析也显示,Faslpr/lpr小鼠的肾脏组织结构紊乱,’肾小球增大,肾小球毛细血管基底膜增厚,有明显的炎性细胞浸润,而miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠肾小球中仅有轻度的炎性细胞浸润,系膜细胞增生现象也得以减轻。我们又通过免疫荧光实验对肾脏免疫复合物的沉积状况进行了检测,结果证实miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠的肾脏中IgM,IgA和C1q的沉积减少。利用ELISA实验对小鼠血清中的自身性抗体进行检测也显示miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠血清中IgM和IgG抗体的滴度降低。在明确了敲除miR-155可缓解Faslpr/lpr小鼠的狼疮样表型之后,我们又通过流式细胞术对两组小鼠T、B淋巴细胞的各亚型的比例进行了检测,结果显示与野生小鼠相比,Faslpr/lpr小鼠脾脏和淋巴结中活化的CD4+(CD4+CD69+)T细胞比例明显增加,而miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠体内活化的CD4+T细胞比例显著降低。此外,Faslpr/lpr小鼠体内CD4+CD8+T细胞的比例异常增高,而miR-155敲除的Faslpr/lpr小鼠CD4+/CD8+T细胞比值明显下降。此外通过CBA(Cytometric beads array)方法对两组小鼠血清中炎症细胞相关因子进行检测,发现与Faslpr/lpr小鼠相比,miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠血清中与Th2和Thl7细胞相关因子IL-4,IL-17a含量减少,而Thl细胞相关细胞因子IFN-γ在两组小鼠中并没有明显改变。我们对小鼠的脾脏进行PNA染色,结果证实狼疮小鼠脾脏中有自发生发中心(Germinal center)的形成,而miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠脾脏生发中心数目明显减少。有研究表明滤泡辅助型T(Tfh)细胞参与SLE的发生发展,于是我们也对该群细胞的比例及其分泌的因子水平进行了检测,结果显示Faslpr/lpr狼疮小鼠淋巴结中Tfh细胞的比例明显增加,ELISA实验结果也证实该小鼠血清中IL-21的浓度增加,而miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠淋巴结中Tfh细胞的比例减少,血清中IL-21的浓度减少。对两组小鼠脾脏中Il-21和Bcl6 mRNA的表达水平检测也发现miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠脾脏中Il-21和Bcl6 mRNA表达水平较Faslpr/lpr小鼠降低。然而对B细胞各亚群(B220+, B220+IgM+, B220+IgD+, B220+CD138+)比例进行检测的结果显示两组小鼠B细胞各亚群均没有明显变化。综合上述结果,我们可以得出如下结论,敲除miR-155可显著缓解Faslpr/1pr小鼠的狼疮样表型。第二部分MiR-155参与SLE发生发展的机制探究MicroRNA的生物学功能主要是通过与靶基因mRNA 3’-UTR区域结合,在转录后水平抑制基因的表达。为了进一步探索miR-155参与SLE发生发展的机制,寻找miR-155参与SLE发生调控的靶基因,我们利用表达谱芯片对miR-155-/-小鼠和野生小鼠的脾脏表达谱进行了差异分析。结果显示与野生型小鼠脾脏相比,miR-155-/-小鼠脾脏有544个基因表达上调和508个基因表达下调(基因表达存在两倍差异并且P<0.05)。通过对表达上调基因与在线软件miRecord预测到的miR-155人和小鼠共有的靶基因利用Venny 2.0软件分析,最终确定了4个共同基因—Satb1、H3f3α、Sla以及S1prl。S1PR1 (Sphingosine-1-phosphate receptor 1)全称为1-磷酸鞘氨醇受体1,属于S1PR家族,参与激活STAT3等多种信号通路。已有研究证实S1PR1能够参与多种自身免疫病的发生发展,我们的研究也发现S1pr1在小鼠的血液、脾脏和淋巴结等免疫组织表达量较高,且SLE患者外周血淋巴细胞以及狼疮小鼠的脾脏细胞中S1PR1基因mRNA和蛋白水平均显著降低,提示其可能参与SLE的发生发展。为了验证miR-155是否直接参与调控SIPR1,我们构建了pmirGLO-S1PR1-3’-UTR载体,与miR-155的mimics或inhibitor共转染HEK293细胞,发现与对照组相比,转染miR-155的：mimmics细胞双荧光素酶报告基因活性明显下降,而与miR-155的inhibitor共转染则可以显著上调双荧光素酶报告基因活性。如果将pmirGLO-S1PR1-3’-UTR载体上与miR-155结合的位点突变后再与miR-155的mimics共转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因的活性并没有显著改变。接下来我们在HEK293细胞中转染miR-155的mimics后,发现S1PR1的表达受到抑制,而转染miR-155的inhibitor则可上调S1PR1的蛋白水平。以上结果均证实S1PR1是miR。155的一个靶基因。至此,我们已在体外细胞水平证实miR-155可以负向调控S1PR1的表达,接下来我们又在小鼠体内对这一结果进行了验证。结果显示与Faslpr/lpr、鼠相比,miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠的脾脏中S1pr1不论是在mRNA水平还是蛋白水平表达均上调,对两组小鼠的肾脏组织切片进行S1pr1的免疫组化实验,结果也证实miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠的肾脏中S1pr1的表达增加,这些均与体外结果相一致。为进一步探索miR-155是否通过调控S1pr1表达参与SLE的发生发展,我们利用S1pr1的特异性拮抗剂W146连续三天腹腔注射miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠,并对小鼠细胞学水平的表型进行了流式检测。结果发现与DMSO处理组小鼠相比,W146处理组miR-155-/-Faslpr/tpr小鼠的脾脏和淋巴结中CD4+/CD8+T细胞的比例异常增加,活化的CD4+T细胞比例增多,并且淋巴结中Tfh细胞的比例增加,这提示S1pr1特异性拮抗剂W146可加重miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠的狼疮样表型。本部分的实验结果证实miR-155可以通过负向调控S1pr1影响SLE的发病进程。第三部分S1PR1的转录表达调控机制研究我们已证实miR-155通过调控S1PR1的表达参与了SLE的发展,这提示S1pr1可能作为临床治疗SLE的潜在靶点。我们利用24例SLE患者和34例正常对照对S1PR1的表达情况进行了检测。实时定量与Western blot结果表明,S1PR1在SLE患者的外周血细胞的mRNA和蛋白水平的表达均低于健康对照,此外,我们还在Faslpr/lpr狼疮小鼠的脾脏细胞中也得到一致的结果,这就提示S1PR1参与了SLE的发生发展。之前已有多篇文献证实S1PR1不仅与SLE的发病相关,并且在多种自身免疫疾病患者的组织中也异常表达,目前以S1PR1为靶点治疗自身免疫病已有相关的报道并取得了良好的进展。FTY720(Fingolimod,芬戈莫德)是目前治疗自身免疫疾病多发性硬化症(Multiple sclerosis, MS)的常用药物,其作用靶点之一即为S1PR1。那么,S1PR1除了受microRNA的表观调控外,其转录表达调控机制是什么?是否对治疗自身免疫疾病提供潜在的治疗价值?基于以上问题我们对S1PR1的启动子区域进行了分析,并对可能调控S1PR1的转录因子进行了初步的鉴定。我们首先分析了S1PR1转录起始点至上游-1 kb启动子区域,将系列截短的序列克隆到pGL3-basic载体中,转染HEK293和HeLa细胞系,依次检测双荧光素酶报告基因的活性,结果显示当序列由-29截短到-12 bp时,双荧光素酶的活性显著降低,这提示该区域内可能存在转录因子的结合位点。在该区域引入突变后,荧光素酶的活性明显降低,进一步证实该区域有正向调控的转录因子的结合。我们通过PROMO, Jaspar等软件预测该区域结合的可能的转录因子,发现有ETS1、FLI1、ELK1、STAT1、STAT3、STAT4、STAT6、C-MYC等转录因子的结合位点。我们通过凝胶电泳迁移率实验(EMSA)和超迁移率(Supershift)实验对这些可能结合的转录因子进行排除及验证,结果表明只有p-STAT1抗体与核蛋白孵育后,热探针与核蛋白的结合条带发生改变,提示p-STAT1可能结合于S1PR1启动子的该区域。通过建立STAT1过表达及低表达细胞系,我们发现在过表达STAT1的HeLa细胞系中,S1PR1的mRNA和蛋白水平的表达显著上调,而在STAT1低表达的HeLa细胞系内S1PR1的mRNA水平表达减少,说明STAT1正向调控S1PR1的表达。以上结果也在HEK293细胞系中得到证实。在高表达STAT1的HeLa细胞系转染-29 bp荧光素酶载体,双荧光素酶报告基因的活性明显增强,而转染-29bp突变载体以及-12 bp的截短荧光素酶载体时,由于二者均不包含STAT1结合位点,其荧光素酶活性并没有明显变化；相对应的,在HeLa细胞中敲低STAT1的表达后,包含STAT1结合位点的野生型载体双荧光素酶报告基因活性明显降低,而-29 bp突变载体以及-12 bp的截短载体报告基因活性没有明显变化。为验证STAT1参与调控S1PR1的表达,我们又进行了一系列的功能实验,结果证实当用STAT1的激活剂IFN-y处理HeLa细胞时,发现伴随着STAT1的激活,S1PR1蛋白水平表达增加；而用STAT1特异性抑制剂Fludarabine处理HeLa细胞后,S1PR1蛋白水平的表达下调。另外,我们提取HeLa细胞的蛋白进行染色质免疫沉淀(Chromatin immnunoprecipitation, ChIP)实验,结果证实在生理条件下,STAT1可以与S1PR1上游启动子区域直接结合。接下来我们又在41个健康个体的外周血淋巴细胞中对STAT1与S1PR1在转录水平的关系进行了探究,实时定量结果发现,STAT1与S1PR1在mRNA表达水平上呈现明显的线性正相关(R2=0.4439,P<0.01)。通过本部分的实验结果,我们发现STAT1可以与S1PR1转录起始点上游-29—-12 bp的区域结合进而正向调控S1PR1的表达。