柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing,HLB）是柑橘生产上最具毁灭性的细菌病害,已对全球的柑橘产业造成了巨大的经济损失。其主要致病菌为韧皮部杆菌属亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）。目前在柑橘属植物中没有发现抗HLB的种质,也没有从感病植株中彻底根除黄龙病菌的有效方法。培育抗病品种是控制黄龙病最根本的方法,对柑橘产业的可持续健康发展有至关重要的作用。诱导植物产生系统获得抗性,以及在植物中表达对病原菌有杀灭作用的外源基因是目前抗病育种的重要手段。因此,本论文从上述2个抗病策略出发,通过同源基因和系统发育进化分析,从耐HLB的‘Jackson’葡萄柚（Citrus paradisi Macf.）中获得了2个与系统获得抗性相关的病程相关基因非表达子（nonexpressor of pathogenesis-related gene,NPR）Ciclev10031343m和Ciclev10031749m,分别被命名为CiNPR3和CiNPR4。同时,利用连接多肽LP4和2A分别连接人溶菌酶和抗菌肽Cecropin B基因,构建了2个融合基因HPC和HAC。构建上述基因的超量表达载体,将CiNPR3、CiNPR4、HPC和HAC分别导入易感HLB的晚锦橙（C.sinensis Osbeck）基因组中,获得能够稳定表达目的基因的转基因植株。通过嫁接传毒的方式将CLas接种于转基因植株上,传病后的植株在28℃的温室中培养2年。培养期间通过监测转基因植株中CLas含量、观察植株的发病症状对转基因植株进行HLB的抗性评价。对HLB抗性增强的转基因植株分析其叶片中的淀粉含量和观察韧皮部结构的变化。对抗HLB的CiNPR3和CiNPR4转基因植株的转录谱变化、CiNPR3和CiNPR4的互作蛋白、以及水杨酸（salicylic acid,SA）和茉莉酸（jasmonic acid,JA）信号通路中防御反应相关基因表达水平的变化进行研究,解析CiNPR3和CiNPR4调控柑橘黄龙病抗性的机制。对抗HLB的HPC和HAC转基因植株中胼胝质合成酶基因和淀粉合成相关基因的表达水平进行分析,评价HPC或HAC的导入对柑橘产生HLB抗性的作用。主要研究结果如下:1.超量表达目的基因的转基因植株的创制为了评价CiNPR3、CiNPR4、HPC和HAC基因对HLB抗性的影响,通过农杆菌介导的遗传转化将这4个基因导入晚锦橙,分别获得CiNPR3、CiNPR4、HPC和HAC转基因株系30、26、56和64个。实时荧光定量PCR证实CiNPR3和CiNPR4分别在CiNPR3和CiNPR4转基因植株中获得表达,人溶菌酶和Cecropin B基因在HPC和HAC转基因植株中均获得表达。Western blotting证实HPC和HAC融合蛋白分别在HPC和HAC转基因植株中成功表达。转基因植株的形态表型与野生型（wild-type,WT）植株没有明显差异。2.超量表达CiNPR3、CiNPR4、HPC或HAC的转基因植株产生了HLB抗性转基因植株在接种CLas 9个月时,57.1%（16/28）的CiNPR3、61.5%（16/26）的CiNPR4、72.7%（16/22）的HPC和57.1%（12/21）的HAC转基因株系中CLas含量显著低于WT植株。接种CLas 18个月时,10个CiNPR3、7个CiNPR4、10个HPC和7个HAC转基因株系中的CLas含量显著低于WT植株。接种CLas 24个月后,9个CiNPR3、7个CiNPR4、7个HPC和7个HAC转基因株系中的CLas含量仍然显著低于WT植株。这些结果表明,超量表达CiNPR3、CiNPR4、HPC或HAC显著抑制了CLas病原菌的增殖。接种CLas 9个月后,在WT植株和部分转基因植株上可以观察到明显的HLB症状。病树上新萌发的叶片变黄变小,有的叶片叶脉突出。随着发病时间的延长,植株生长迟缓,一些植株的顶端逐步枯死。接种CLas 24个月后,28.6%（8/28）的CiNPR3转基因株系、23.1%（6/26）的CiNPR4转基因株系、27.3%（6/22）的HPC转基因株系和19.0%（4/21）的HAC转基因株系没有出现明显的HLB症状。这些结果表明,超量表达CiNPR3、CiNPR4、HPC或HAC降低了韧皮部中CLas含量,从而减轻了转基因植株的HLB症状,植株表现出了对HLB的抗性。3.转基因植株应答黄龙病菌感染的解剖结构和淀粉含量的变化接种CLas 24个月后,对具有HLB抗性的CiNPR3、CiNPR4、HPC和HAC转基因植株韧皮部的结构进行了感病前和感病后的解剖观察。健康的CiNPR3、CiNPR4、HPC和HAC转基因植株的韧皮部结构与健康的WT植株相比无差异。与健康的WT植株相比,感病的CiNPR3、CiNPR4、HPC和HAC转基因植株的韧皮部层变宽,韧皮部薄壁细胞膨大、排列疏松但有规律;韧皮部中的胼胝质增多。感病的WT植株的韧皮部层比感病的CiNPR3、CiNPR4、HPC和HAC转基因植株的韧皮部层明显更宽,韧皮部薄壁细胞间隙较大且在韧皮部层散乱排列;韧皮部中的胼胝质较多。这些结果表明,超量表达CiNPR3、CiNPR4、HPC或HAC并未改变晚锦橙的韧皮部结构,但却减轻了CLas对韧皮部结构的破坏。接种CLas 24个月后,具有HLB抗性的转基因植株叶片中的淀粉含量增加,显著高于健康的WT植株叶片中的淀粉含量,但显著低于感病的WT植株叶片中的淀粉含量。这些结果表明超量表达CiNPR3、CiNPR4、HPC或HAC降低了转基因柑橘叶片中因CLas感染所致的淀粉积累。4.超量表达CiNPR3或CiNPR4抗柑橘黄龙病的机制解析4.1超量表达CiNPR3或CiNPR4转基因植株的转录组学研究接种CLas 18个月后,随机各挑选一株具有HLB抗性的CiNPR3转基因植株C3-29和CiNPR4转基因植株C4-2,以及WT植株进行感病前和感病后的转录组分析,通过KEGG分析差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）参与的代谢或信号转导途径。感病前,与健康的WT植株相比,CiNPR3转基因植株C3-29中的DEGs显著富集在光合作用-天线蛋白、氨基糖和核苷酸糖代谢、光合作用通路;而CiNPR4转基因植株C4-2中的DEGs显著富集在光合作用-天线蛋白、α-亚麻酸代谢和植物激素信号转导途径。感病后,与各自健康的植株相比,CiNPR3转基因植株中的DEGs显著富集在苯丙氨酸代谢途径、内质网蛋白质加工过程;CiNPR4转基因植株中的DEGs显著富集在植物–病原物互作通路、光合作用和α-亚麻酸代谢途径;而WT植株中的DEGs显著富集在柠檬烯和蒎烯的降解、二苯乙烯类、二芳基庚烷类和姜辣素生物合成途径。这些结果表明,超量表达CiNPR3或CiNPR4并未显著增强转基因植株的基础防御能力,但超量表达CiNPR4后转基因植株受病原菌诱导的基础防御抗性明显增强。4.2 CiNPR3和CiNPR4蛋白分别与CsTGA6和CsTGA2转录因子互作对来源于‘Jackson’葡萄柚的CiNPR3和CiNPR4通过蛋白与蛋白相互作用的亚网络分析发现,这两个蛋白都与Ciclev10005080m和Ciclev10001081m基因所编码的蛋白相结合。以甜橙为参考基因组,经过序列比对,发现Ciclev10005080m基因编码的氨基酸序列与Cs5g11160.1基因编码的氨基酸序列完全相同,而Ciclev10001081m基因编码的氨基酸序列与Cs1g16230.4基因编码的氨基酸序列有98.9%的相似性。功能注释表明,Cs1g16230.4和Cs5g11160.1分别为TGA6和TGA2转录因子基因（命名为CsTGA6和CsTGA2）。进一步,酵母双杂交分析证明CiNPR3与CsTGA6、CiNPR4与CsTGA2存在互作。4.3超量表达CiNPR3或CiNPR4显著地提高了转基因植株体内的系统获得抗性和诱导系统抗性接种CLas 18个月时,对CiNPR3和CiNPR4转基因植株中SA和JA分别介导的防御反应标志性基因CsPR1、CsPR2和CsPR5,和CsPDF1.2进行了感病前和感病后的表达分析。感病前,与WT植株相比,SA介导的CsPR1在所有的CiNPR3和CiNPR4转基因植株中显著上调表达;CsPR2在所有的CiNPR3转基因植株中显著下调表达,而在CiNPR4转基因植株中显著下调表达或表达水平无差异;CsPR5在所有的CiNPR3和CiNPR4转基因植株中表达水平无显著变化;而JA介导的防御反应相关基因CsPDF1.2在超量表达CiNPR3和CiNPR4的转基因植株中显著上调表达或表达水平无差异。感病后,WT植株中CsPR1和CsPR2上调表达,CsPR5的表达水平基本保持不变,而JA介导的CsPDF1.2的表达水平略微下调;而所有的CiNPR3和CiNPR4转基因植株中CsPR1、CsPR2、CsPR5和CsPDF1.2基因上调表达,且上调表达的倍数变化显著高于WT植株。这些结果表明超量表达CiNPR3或CiNPR4不但增强了CsPR1介导的基础防御反应和JA介导的病原菌感染引起的诱导系统抗性,而且使转基因植株获得了比WT植株更强的病原菌诱导的系统获得抗性。综上所述,超量表达CiNPR3或CiNPR4后甜橙产生HLB抗性的可能机制为:CiNPR3通过与CsTGA6转录因子结合,激活SA介导的PR基因和JA介导的PDF1.2基因的表达,启动寄主系统获得抗性和诱导系统抗性,从而增强CiNPR3转基因植株的HLB抗性;而CiNPR4通过与CsTGA2转录因子结合,激活植物（？）病原物互作通路中相关基因的转录,增强寄主的基础抗性,同时上调SA介导的PR基因和JA介导的PDF1.2基因的表达,激活寄主的系统获得抗性和诱导系统抗性,最终赋予转基因植株增强的HLB抗性。5.HPC和HAC转基因植株中胼胝质合成酶基因和淀粉合成相关基因响应CLas感染的表达有较强HLB抗性的HPC和HAC转基因植株在接种CLas 24个月后,其体内的胼胝质合成酶基因Cs Cal S7上调表达,且上调表达的倍数显著高于WT植株;而HPC和HAC转基因植株体内的淀粉合成相关基因如ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因Cs SS13（Cs8g07230.1）和水溶性淀粉合成酶基因Cs SS14（Orange1.1t00566）受CLas诱导表达的上升程度显著低于WT植株,揭示了HPC和HAC转基因植株在感病后淀粉含量较低的原因。这些结果表明,超量表达HPC或HAC对转基因植株中胼胝质合成酶基因和淀粉合成相关基因响应CLas感染的表达有显著影响。