癌症是一种全人类共同的“噩梦”,严重威胁人类健康和生命。胃癌（Gastric cancer）是最常诊断出的癌症之一,在所有癌症发病率中排名第五,而其死亡率却排名第四。近年来,尽管包括外科手术、放射性疗法和化学疗法等在胃癌的治疗方面取得了较大进步,但是晚期胃癌患者的预后仍然很差。化学疗法是一种有效且广泛使用的癌症治疗方法,然而化疗药物在杀灭肿瘤细胞的同时,伴随的高毒副作用也给患者带来了额外的伤痛。因此,筛选和开发低毒、高效的新型抗癌药物和新治疗策略显得迫在眉睫。20世纪50年代,加拿大研究团队在长春花（Madagascar periwinkle）的叶子中发现一种天然成分---长春花碱（vinblastine,又译为长春碱）,随后其被发现具有良好的抗癌效果。长春花碱是一种强效的细胞分裂抑制剂,被用于多种肿瘤的临床治疗,如淋巴瘤、睾丸癌、乳腺癌、膀胱癌和肺癌等。此外,多种长春花提取物或类似物,如长春瑞滨（Vinorelbine）、长春地辛（Vindesine）、长春新碱（Vincristine）、长春花碱（Vinblasine）和长春弗宁（Vinflunine）,具有较好的肿瘤抑制效果,并被批准应用于临床治疗,但其强毒副作用往往也限制了它们在临床上的进一步应用。顺铂（Cisplatin,Cis）是一种被广泛应用于睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、子宫颈癌、头颈癌和胃癌以及其他一些实体瘤治疗的金属基团抗肿瘤药物。在具有良好的肿瘤治疗效果的同时,顺铂同样也表现出很多的毒副作用。顺铂表现出了约40种个体毒性,其中肾毒性是最常见的一种。顺铂的抗癌活性毋庸置疑,但是长期使用所产生的强副作用无疑等同于服用慢性毒药,大大降低了患者的生活质量。长春质碱（Catharanthine）是长春花中的的一种提取物,该生物碱类化合物被进一步修饰为易溶于有机溶剂的硫酸长春质碱（Cathearanthine Sulfate）,简写为CAS,其抗癌活性和机制未见报道。本课题研究发现,CAS具有较好的胃癌抑制效果,能够显著增强顺铂的治疗效果,且能够有效降低顺铂治疗中的毒副作用。本研究所得主要结果如下:1.CAS表现出较好的抗胃癌活性且毒性较低在细胞水平,CAS显著抑制胃癌细胞株SGC-7901和MKN-45的生长,并且呈现明显的时间和剂量依赖效应。利用流式细胞术和蛋白免疫印迹技术对细胞凋亡和凋亡相关关键蛋白的表达情况进行分析和检测,发现CAS并不会诱发经典的细胞凋亡。运用流式细胞术对细胞周期分布情况进行统计分析,发现CAS处理组细胞发生明显的细胞周期阻滞,主要阻滞于G0/G1期;通过蛋白免疫印迹技术对该时期关键调节蛋白,如、CDK2、Cyclin E1及Cyclin E2进行检测,发现细胞周期的负调控因子p21显著上调,而细胞周期依赖性激酶2（CDK2）以及细胞周期蛋白E1和E2（Cyclin E1和Cyclin E2）均显著下调,呈现剂量和时间依赖性。在个体水平,为了验证CAS的体内抗癌效果,课题组成功构建了小鼠皮下人源和细胞来源异种移植瘤模型（PDX和CDX模型）,然后通过腹腔给药方式进行给药处理。结果显示,无论是CDX还是PDX模型,CAS治疗组瘤块体积和质量均显著低于对照组,表明CAS在体内也具有较好的抗癌活性。通过免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）检测移植瘤中增殖相关因子Ki67,发现CAS治疗可以显著性地降低Ki67在这些瘤块中的表达。通过伊红和苏木精染色（H&E staining）发现,经CAS处理小鼠的瘤块发生明显的核质不均一,细胞明显变大且出现胞质空泡化。利用长期毒性试验（Long-term toxicity test）以探究该药物是否对小鼠的脏器产生毒副作用,结果表明经CAS处理后小鼠的重要脏器（心脏、脾脏、肺、肾脏和肝脏）并没有出现明显的病理改变。这些初步的研究结果显示CAS对实验动物无毒或毒性较低,表明该化合物单体具有潜在的临床开发价值,但CAS对小鼠是否具有其他毒副作用仍需作进一步的探究。2.CAS通过激活PERK/ATF4/eIF2α/CHOP和IRE1α/XBP1信号轴诱发损伤性内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）为了探究CAS的抑癌机制,利用转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq）对CAS处理前后的两株胃癌细胞（SGC-7901和MKN-45）差异表达基因进行组学分析。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）表明未折叠蛋白反应（Unfolded protein Response,UPR）相关的基因集显著富集于CAS处理组。GO分析显示经CAS处理后,多个生物过程（Biological process,BP）发生改变,同样包括UPR。经CAS处理后,在SGC-7901细胞中参与内质网应激反应的基因上调多达43个,在MKN-45细胞中有33个,其中在两细胞株中共同上调表达的基因有20个。进一步分析表明这些上调因子属于参与响应PERK和IRE1α跨膜感受器介导的内质网应激相关信号通路;通过蛋白印迹对小鼠异种移植瘤中相关蛋白的表达水平进行检测,发现PERK、ATF4、eIF2α、p-eIF2α、CHOP和IRE1α等均显著上调,表明发现PERK和IRE1α这两条内质网应激通路均被活化。利用基因敲低技术或小分子抑制剂,敲除或抑制PERK和IRE1α通路活性后,可以在一定程度上减弱CAS对细胞的生长抑制作用。这些结果表明,CAS可能通过诱发损伤性内质网应激来抑制肿瘤细胞的生长。3.CAS通过内质网应激激活ATF4/AMPKα/ULK1和XBP1/Beclin-1信号通路介导细胞自噬细胞在应激状态下会启动UPR,诱发ERS,进而也可能会激活细胞自噬。那么CAS诱发的UPR是否也会诱导自噬的发生呢?利用各种策略对自噬标志物LC3B进行检测,发现经CAS处理的细胞或肿瘤组织中LC3B的蛋白表达水平显著上调,LC3B信号出现大量的点状聚集。在电子显微镜下,CAS处理组细胞或肿瘤组织中后观察到大量积聚的自噬小体。这些结果表明CAS能够显著诱发细胞自噬。为了进一步探究内质网应激和自噬的关系,通过RNA干扰技术和特异性抑制剂,敲低或抑制内质网应激相关跨膜感受器PERK和IRE1α的表达水平或活性,发现CAS诱导的细胞自噬水平受到了较大程度的抑制,表明CAS介导的细胞自噬与ERS密切相关。通常情况下,UPR通过PERK、ATF6和IRE1α这三条经典的通路调节包括mTOR、AMPKα和Beclin-1/ATG在内的多条自噬通路,进而调节细胞自噬的发生。为了探究CAS诱导细胞自噬发生的下游通路,通过蛋白印迹技术对相关蛋白的表达变化进行检测,发现CAS 能够显著激活ATF4/AMPKα/ULK1 和XBP1/Beclin-1/ATG信号轴。当这两条信号通路的同时阻断可以最大限度地抑制自噬的发生。这些研究结果表明ATF4/AMPKα/ULK1和XBP1/Beclin-1/ATG信号通路活化是CAS诱导细胞自噬所必需的。4.CAS通过靶向细胞骨架系统破坏自噬流自噬的发生往往存在两种状态,即自噬通量流通和自噬通量阻断。通过联合多种自噬激活剂或者抑制剂以探究自噬流的状态。研究发现PI3K特异性抑制剂3-MA可以显著降低CAS诱发的自噬水平,自噬激活剂雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）能够进一步增强细胞自噬水平,而自噬流阻断剂Bafilomycin A1（Baf A1）或氯喹（Chloroquine,CQ）则不能够增强CAS诱发的自噬水平。自噬双标系统mRFP-GFP-LC3是自噬流研究必不可少的工具,能够通过追踪红绿荧光信号来判断自噬流通情况。通过荧光观察,发现CAS处理组细胞中所有的点状自噬信号均为黄色,这些结果初步表明CAS发挥自噬阻断作用。紧接着,为了更直接地验证CAS是否影响了自噬小体与溶酶体的融合,通过LC3-GFP与溶酶体标记物Lyso-tracker或LAMP1进行共定位分析。免疫荧光结果表明,CAS处理48 h后LC3B点状信号与溶酶体并无明显共定位,这些结果表明CAS诱发的自噬阻断可能发生于自噬早期。为了进一步探究自噬流阻断的机制,对RNA-Seq结果进行了进一步的分析,发现CAS处理后,微管和微丝相关基因显著下调。利用鬼笔环肽标记细胞微丝结构,发现CAS处理组细胞发生明显的微丝解聚。这种解聚有别于因自噬激活本身所造成的功能性解聚,因为CAS处理后除了微丝解聚,还伴随β-actin蛋白表达的下调,此外,解聚的actin蛋白与LC3B并无明显的共定位。CAS对细胞骨架系统造成了较大的破坏,尤其对微管和微丝。自噬的发生是一个非常复杂的生理代谢过程,许多细胞器均参与完成了这个过程。细胞骨架作为细胞的一个支撑系统,对维持细胞的正常生理、代谢是必需的。许多报道已表明骨架系统在细胞自噬的发生过程中同样扮演重要角色。不同于长春新碱对微管系统造成的显著性解聚,CAS处理后却导致了细胞微管组织的重塑;微管重塑是细胞应对外界刺激所发生的适应性变化,而微管的重塑往往对其执行的功能产生不利影响。蛋白印迹检测发现经CAS处理的细胞中,β-tubulin蛋白的表达明显被下调。以上研究结果表明CAS诱发的自噬流阻断的主要原因是细胞骨架系统功能障碍所介导的。大多数长春花碱提取物具有微管靶向性,为了深入探究CAS是否对细胞骨架系统具有靶向性,通过计算机模拟分子对接,我们发现配体分子CAS与其受体分子β-actin的氨基酸残基可以通过疏水作用力、芳环堆积力结合;此外,CAS还可以通过氢键与β-tubulin的ASP457、GLU502、LYS449、LYS498残基发生物理性结合。细胞热位移实验显示经CAS处理的细胞中,无论β-actin还是β-tubulin均具有更强的热稳定性。这些结果表明CAS与β-actin和β-tubulin通过物理作用力发生结合,进而破坏细胞骨架系统,导致骨架功能障碍。5.CAS介导的自噬阻断增强了顺铂的化疗敏感性并提高了荷瘤小鼠的生存能力我们探究CAS与顺铂联合使用是否仍然会介导细胞自噬。通过对自噬标志物LC3B的表达进行检测,发现联合用药依然导致了自噬的发生。比较有趣的是,SQSTM1的表达也被上调,提示联合用药仍然是会导致自噬流的阻断。通过MTT和平板克隆实验,其结果表明联合治疗策略对胃癌细胞具有更佳的抑制效果。为了评估联合策略的可行性和有效性,我们通过单剂量急性毒性试验（single dose acute toxicity）和亚慢性毒性试验（long term toxicity test）发现,CAS 与 Cis 联合治疗可以减轻Cis单药治疗出现的脏器和组织损伤,尤其是对肾脏、胃肠的损伤。通过Chou-Talalay的方法评估CAS联合Cis是否具有协同治疗胃癌的作用,结果表明CAS在一个广泛的Cis浓度范围内与其联合具有协同抑制胃癌的作用（联合系数Combination Index,CI<1.0）;进一步检测发现联合化疗能够实现在较低浓度的Cis条件下诱发更加显著的DNA损伤,进而导致凋亡的发生。皮下异种移植瘤实验显示,相较于任一单药治疗,联合策略对肿瘤具有更佳的抑制效果。为了探究联合治疗策略是否对可以延长原位荷瘤小鼠的生存期,我们构建了两位病人来源的原位异种移植瘤模型,通过阶段性药物治疗后,发现CAS与Cis联合治疗可以进一步延长患癌小鼠的生存期。这些结果表明CAS介导的自噬流阻断效应增强了 Cis对胃癌的化疗敏感性,并且延长了原位瘤小鼠的生存期。总之,这些研究结果表明,CAS通过激活ERS依赖性的自噬,同时又通过物理结合至细胞骨架系统,造成细胞骨架功能障碍,进而破坏自噬流。我们的研究结果还表明,CAS介导的自噬流破坏在细胞生存中扮演了消极的角色。重要的是,CAS可与Cis发挥协同抑癌作用,同时可以拮抗Cis诱发的个体毒性。因此,这些结果表明,CAS与Cis联合使用是一种可行的胃癌治疗方法,可为其在胃癌治疗中的潜在应用提供临床前见解。