研究背景及目的表皮渗透屏障功能(epidermal permeability barrier function)主要是在表皮外层(exterior layers)如颗粒层和角质层中完成的。终末分化的角质形成细胞(keratinocyte, KC)至颗粒层,开始合成富含脂质的颗粒,又被称为板层小体(lamellar body)。板层小体随后被释放至角质层细胞(stratum corneum)的胞外间隙,形成表皮渗透屏障功能结构基础。角质层细胞被称作“砖”,而胞外间隙中存在的板层状脂质膜(lamellar membrane)被称作“灰”,这就是表皮渗透屏障的“砖和灰(brick and mortar)’结构学说。目前对板层小体分泌调节与维持板层脂膜完整性的确切机制仍然不清楚。人们还发现生理状态下表皮内存在细胞外钙离子梯度(extracellular calcium gradient),即基底层细胞外钙离子浓度最低,至颗粒层时最高,进入角质层钙离子浓度又下降。有人认为这一钙离子梯度可能与维持KC等级分化(graded differentiation)和调控颗粒层细胞的板层小体分泌相关。但钙离子梯度形成的原因尚不明确。我们推测被转移至KC内的黑素小体,随KC终末分化抵达至颗粒层,此时黑素小体几乎被完全降解,被预存在黑素分子中的钙离子可能被释放出来参与维持钙离子梯度形成。临床上白癜风皮损内黑素减少甚至缺失,为我们探讨“黑素-钙梯度-表皮屏障”三者之间的关联提供了一个有价值的体内模型。本论文通过对白癜风色素脱失皮损屏障功能测定、角质层板层脂膜超微结构与表皮钙离子梯度观察以及相关增殖活化细胞因子的研究,旨在探讨黑素对人表皮渗透性屏障的超微结构与功能影响以及表皮渗透屏障功能的分子调控机制。皮肤渗透屏障功能主要是指防止过多的水分进入机体内以及体内的水分丢失,角质层细胞间的板层状脂质膜构成该渗透屏障结构基础。故此,我们(第一部分)首先利用透射电镜比较观察白癜风皮损和正常皮肤角质层细胞间板状脂膜的超微结构变化,以观察色素脱失对皮肤屏障的结构基础的影响。随后,我们(第二部分)对白癜风脱色素皮损和对应部位正常皮肤的透皮水分丢失(transepidermal water loss,TEWL)进行检测。已知衡量皮肤屏障功能的主要方法是测量TEWL速度和渗透屏障功能破坏后的恢复率。目前对深色皮肤和浅色皮肤的屏障功能比较结果有很大争议。基于此,比较分析白癜风脱色素皮损和对应部位正常皮肤TEWL值测定,旨在探讨黑素对皮肤渗透屏障功能的影响。目前的研究数据证实在正常表皮内存在着钙离子浓度梯度。这种钙离子浓度梯度对于表皮的增生、分化、细胞间连接及屏障功能起着至关重要的作用。细胞外低浓度钙促进角质形成细胞增生；高浓度钙促进角质形成细胞分化、细胞间黏附。完整的表皮屏障功能是保证表皮钙离子浓度梯度的前提。为进一步证实皮肤黑素丢失是否导致钙梯度的分布紊乱,我们(第三部分)又采用离子捕获细胞化学法结合透射电镜技术对白癜风表皮和正常皮肤钙离子分布进行超微定位观察,旨在研究黑素脱失对钙离子分布影响。钙离子梯度的紊乱是否影响KC等级分化以及表皮细胞的稳态有待证实。最后,我们(第四部分)用免疫组化技术比较分析了白癜风皮损和正常皮肤HMB-45,K15,Ki67和FHL2蛋白质的表达。HMB-45抗体能识别黑素细胞特异性抗原gp100蛋白,gp100蛋白是专一分布在黑素小体膜上与黑素合成相关的结构蛋白,被认为是分化成熟黑素细胞的一个重要标志性分子；Ki-67抗原是一种与细胞增殖密切相关的核抗原,其表达强弱可直接反映细胞的增殖活性；在正常生理状态下,皮肤具有保持自身结构稳定的能力,皮肤更新与稳态(homeostasis)取决于表皮干细胞(Epidermal stem cells ESCs)增殖和分化之间的平衡。角蛋白15(K15)被认为是复层鳞状上皮基底层干细胞特征性标志蛋白之一;FHL(four and half LIM domains,FHL)蛋白是指一种含有4个半LIM结构域蛋白家族成员。FHL2参与调控基因的表达、信号转导、细胞骨架形成和细胞的黏附和转移,在正常组织的生长发育中起十分重要的作用。我们通过免疫组化方法对白癜风皮损与正常皮肤的上述蛋白表达进行检测,旨在了解表皮黑素对角质形成细胞稳态的影响。研究方法与结果1.用Ru04电子特染结合透射电镜技术比较白癜风脱色皮损和正常皮肤表皮角质层板层脂膜超微结构,结果显示正常皮肤角质层细胞间隙有4-8层排列规整,电子致密带和透明带重复交替排列的片层状结构。而白癜风脱色皮损角质层细胞间隙扩大,板层结构断裂,出现空泡,空泡内充填有无形电子致密物。2.用多功能皮肤生理仪测量白癜风皮损和对侧正常皮肤透皮失水率,结果发现白癜风组TEWL为11.13±1.04 g/m2/h,对侧正常皮肤组TEWL为10.38±1.26g/m2/h；两组之间差异没有统计学意义(P>0.05)。同时,利用胶带破坏皮肤屏障功能,然后分别在0h及5h后分别测量透皮失水率,并计算其恢复速度,结果发现白癜风经皮失水的恢复速率为41.29±4.03%,对侧正常皮肤经皮失水的恢复速率为59.47±4.23%,白癜风组透皮失水率的恢复速度明显地低于正常对侧皮肤组,两组之间差异均有统计学意义(P<0.05)。3.离子捕获细胞化学法结合透射电镜技术比较观察白癜风脱色皮损和正常皮肤表皮钙离子分布,结果发现正常皮肤的颗粒层可见到粗大的钙沉淀颗粒,基底层细胞间可见较少的细颗粒沉淀,同时基底层存在较多的椭圆形IV期黑素小体,而白癜风皮损颗粒层可见钙沉淀颗粒明显减少,基底层可见细小钙沉淀颗粒、数目也明显减少,几乎完全缺乏黑素小体。4.用免疫组化法检测白癜风皮损和正常皮肤HMB45、Ki67、K15和FHL2表达,用IPP6.0软件半定量测量每个细胞因子表达情况,并经统计学分析,结果发现正常皮肤HMB45阳性表达,黑素细胞部分胞质染成棕黄色,细胞胞体大,空泡样,圆形,胞核小,胞浆周边黄染着色深浅不一,白癜风脱色素皮损HMB45阴性表达；K15在基底层细胞胞浆表达,呈棕黄色,核不着色,基底层以上细胞不着色,白癜风组K15表达值为0.1267±0.0514,正常皮肤组K15为0.1263±0.0172,两组之间差异没有统计学意义(P>0.05)；K.i-67阳性细胞定位于细胞核,胞核有境界清晰棕色、棕褐色颗粒沉着,正常皮肤组织主要局限于有增殖能力的基底层,棘细胞层仅个别细胞有着色。白癜风皮损除基底层外在棘细胞层亦有表达,而且有较密集的细胞着色,白癜风组ki67表达值为0.1075±0.0802,正常皮肤组ki67为0.0608±0.0483,两组之间差异均有统计学意义(P<0.05)；FHL2主要表达在细胞浆及胞核,呈棕黄色颗粒,FHL2在白癜风脱色素皮损中细胞胞浆染色较强,棕黄色颗粒较粗大。FHL2在正常皮肤中表达较弱,白癜风组FHL2表达值为0.2905±0.0332,正常皮肤组FHL2为0.1428±0.0341,两组之间差异均有统计学意义(P<0.05)；研究结论白癜风皮损存在角质层板层脂膜结构的异常,结果提示黑素缺失可能导致表皮角质层板层脂膜结构的紊乱；白癜风皮损和正常皮肤基础渗透屏障功能(TEWL)无明显异常,但白癜风皮损存在渗透屏障功能恢复能力的异常,结果表明表皮黑素对皮肤屏障功能的维持至关重要；白癜风皮损存在钙离子梯度的消失,我们推测了表皮黑素可能参与了钙梯度形成与维持；白癜风表皮缺乏HMB45阳性染色细胞,Ki67表达轻度增高,K15表达无差异,FHL2表达增高。这些免疫组化结果提示白癜风黑素脱失皮损的确存在角质形成细胞增殖轻度增加,FHL2蛋白表达上调是否关系到与白癜风皮损残留黑素细胞酪氨酸酶活性的抑制有待进一步证实。