研究目的:溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一种嗜盐革兰氏阴性弧菌,在水域环境广泛分布。作为弧菌属（Vibrio）的主要致病菌之一,V.alginolyticus对海洋渔业的可持续发展不断造成消极影响;另一方面,其作为食源性机会致病菌,可造成人类急性胃肠道感染及败血症等病症,感染免疫功能不全的患者后更易引发多重组织功能失调,常因延误最佳治疗时机而危及性命。然而,由于常规方法检测费时、操作繁琐,目前尚缺乏从感染动物或人体中确诊V.alginolyticus感染的快速实时特异性检测方法。近年来,群体感应（Quorum Sensing,QS）现象调控细菌感染的相关研究日益增多,为V.alginolyticus相关感染机制提供了一个新颖的研究角度,但N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl homoserine lactones,AHLs）类化合物作为V.alginolyticus产生的一类重要QS信号分子,其详细情况尚未被系统测定和分析,导致AHL-QS系统对V.alginolyticus致病进程调控的相关研究也极为缺乏,严重制约着对其感染及相关危害的进一步研究。因此,本研究从V.alginolyticus的快速鉴定入手,对其AHL类QS信号分子的产生进行系统检测及分析,并探讨AHLs对V.alginolyticus生理功能的调控,旨在为V.alginolyticus相关感染机制的研究奠定理论基础。研究方法:（一）靶向V.alginolyticus toxR基因的8个不同区域,设计特异性引物,采用Bst热启动DNA聚合酶和SYTO-9等商品化试剂,基于环介导等温扩增技术,创建一种V.alginolyticus快速鉴定方法,对其纯菌液、小鼠和扇贝感染模型中不同浓度的V.alginolyticus分别进行特异性检测,并同时通过16s rDNA测序法验证其检测结果,对改良型环介导等温实时扩增法的灵敏性、敏感性等方面进行评估。（二）采用生物学方法和理化方法对V.alginolyticus产生AHLs的详细情况进行系统测定及分析。应用微生物感应菌株与V.alginolyticus交叉共培养的方法对47株V.alginolyticus产生的AHL-QS信号分子进行生物学测定,包括紫色色杆菌自然突变株CV026检测其产生短链AHLs和根癌农杆菌KYC55检测其产生长链AHLs,以明确AHLs的产生范围;应用条件优化的HPLC-MS/MS方法对14种AHLs进行理化学测定,包括7种短链AHLs（C₄-HSL、3-OH-C₄-HSL、C₆-HSL、3-oxo-C₆-HSL、C₈-HSL、3-OH-C₈-HSL和3-oxo-C₈-HSL）及7种长链AHLs(C₁₀-HSL、3-oxo-C₁₀-HSL、C₁₂-HSL、3-OH-C₁₂-HSL、3-oxo-C₁₂-HSL、3-OH-C₁₄-HSL和3-oxo-C₁₄-HSL),以进一步明确V.alginolyticus产生AHLs的详细种类和产生浓度,并依据产生浓度对AHLs进行分级,确定V.alginolyticus QS信号分子的产生特点及优势AHLs。（三）利用廉价易获取原料,人工合成V.alginolyticus重要的QS信号分子3-oxo-C₆-HSL、3-oxo-C₁₀-HSL和C₁₂-HSL。首先分别以正丁酸和正辛酸为原料,经米氏酸缩合反应后,甲醇回流脱缩,在碱性条件下经酯水解获得3-氧代己酸和3-氧代癸酸,作为酰基侧链第三位碳原子含羰基取代基AHLs合成的前体物质,然后在限温条件下,将获得的3-氧代己酸、3-氧代癸酸以及月桂酸在二氯甲烷和三乙胺催化下与L-高丝氨酸内酯盐进行缩合,分别得终产物3-oxo-C₆-HSL、3-oxo-C₁₀-HSL和C₁₂-HSL。利用理化方法对人工合成的AHLs进行详细鉴定,包括核磁共振氢谱技术构绘其化学结构、质谱技术预测其分子量和高压液相色谱技术确定其合成纯度。在理化学方法的基础上,采用微生物敏感菌株共培养法对人工合成AHLs进行鉴定,包括合成的3-oxo-C₆-HSL能否诱导紫色色杆菌突变株CV026菌落产生紫色变化和3-oxo-C₁₀-HSL、C₁₂-HSL能否诱导大肠杆菌MG4（pKDT17）产生蓝色菌落,已明确三者是否具备生物活性。（四）V.alginolyticus菌株常规培养0 h–120 h,并采用梯度稀释平板计数法检测其增殖情况,以培养时间为X轴、CFU/m L浓度为Y轴绘制V.alginolyticus增殖曲线并筛选最优培养时间;在最优培养时间下,半定量黏附法检测47株V.alginolyticus的生物膜形成情况,并根据生物膜水平进行V.alginolyticus的分级;结合3-oxo-C₁₀-HSL的产生水平,筛选2株在生物膜形成和3-oxo-C₁₀-HSL产生水平上均具有显著差别的V.alginolyticus N°24和N°40。将V.alginolyticus N°24和N°40在最优时间下常规培养0 h–120 h,采用荧光显微染色法观察其生物膜形成形态,以确定2株V.alginolyticus的生物膜形成周期。分别在不同温度和盐度下培养V.alginolyticus,以观察环境因素对其生物膜形成的影响,具体包括:在不同温度（4℃、16℃、28℃和40℃）下培养36 h,采用梯度稀释平板计数法检测其增殖力,半定量黏附法检测其生物膜形成量,以探讨极寒、较低、常规和极热温度对V.alginolyticus生物膜形成的影响;根据以上结果,筛选最适培养温度（16℃和28℃）,以不同盐度（0.5%、1%、3.5%和6.5%）培养36 h,采用梯度稀释平板计数法检测其增殖力,半定量黏附法检测其生物膜形成量,以探讨寡盐、一般、富盐和嗜盐环境对V.alginolyticus生物膜形成的影响,以及进一步分析常见环境变化因素（温度和盐度）对V.alginolyticus生物膜形成的相互影响。分别使用不同浓度外源3-oxo-C₁₀-HSL（1μM、2μM、5μM、10μM、40μM和100μM）处理V.alginolyticus,以观察单一AHL对其生物膜形成的作用,具体包括:在不同温度（16℃和28℃）下培养36 h,采用梯度稀释平板计数法检测其增殖力,半定量黏附法检测其生物膜形成量,以探讨外源3-oxo-C₁₀-HSL对V.alginolyticus生物膜形成量的影响;采用激光共聚焦显微法对V.alginolyticus的生物膜形态进行观察并3D模拟重建,从形态学的角度探讨外源3-oxo-C₁₀-HSL对V.alginolyticus生物膜形成规模和状态的影响;使用COMSTAT软件针对生物膜基质的5个特征性参数进行分析,分别从生物量、基质厚度、粗糙程度和微克隆菌落数方面对3-oxo-C₁₀-HSL影响V.alginolyticus生物膜的形成进行系统分析。研究结果:（一）对纯菌液、小鼠和扇贝感染模型中V.alginolyticus的特异性检测结果如下:（1）在ESE-Quant-LAMP、qPCR-LAMP两种模式下检测1×10⁰ CFU/mL–1×10⁹ CFU/m L V.alginolyticus纯培养液,其检测最低限均为1×10² CFU/m L,证实改良型LAMP法在检测V.alginolyticus纯培养物方面具有良好的灵敏度;（2）在ESE-Quant-LAMP模式下对12株包括弧菌属和非弧菌属在内的菌液进行检测,V.alginolyticus的检测结果均为阳性,其余菌种均为阴性;在qPCR-LAMP模式下对92株海洋分离菌株培养液进行检测,均呈现阳性结果,“S”型曲线弧度良好,经16s rDNA验证,证实改良型LAMP法在检测V.alginolyticus纯培养物方面具有良好的特异性;（3）使用qPCR-LAMP法对弧菌感染小鼠模型的血液进行细菌残留的检测,6组待测样品中,V.alginolyticus感染组的血液检测为阳性结果,伴随弧度各异的“S”型曲线,其余弧菌感染组血液样本检测为阴性,证实改良型LAMP法可应用于V.alginolyticus感染哺乳动物血液的检测;（4）使用ESE-Quant-LAMP法对V.alginolyticus污染的扇贝浸出液进行环境细菌残留检测,6组待测样品中,V.alginolyticus感染组的扇贝浸出液检测结果为阳性,对照组检测结果为阴性,证实改良型LAMP法可应用于V.alginolyticus感染海洋生物制品的快速检测。（二）首先对HPLC-MS/MS的条件进行了细致的优化,包括:a.色谱上样缓冲液AB相、流速、分析时间和梯度洗脱条件;b.质谱的气帘电压、锥孔电压等;c.AHLs特征性裂解碎片及最优m/z。在此基础上,以14种AHLs标准化合物为基准,分别制备了检测V.alginolyticus信号分子产生所需的标准曲线,且线性关系均在0.99以上。将生物学方法和理化方法的检测结果进行结合并分析,V.alginolyticus产生AHLs的详细情况如下:（1）应用微生物敏感菌株分别对V.alginolyticus短链和长链AHLs的产生范围进行检测,提示其产生短链AHLs的浓度极低,存在不产生短链AHLs的可能性,长链AHLs产生范围广,且产生浓度差异性较大;（2）通过HPLC-MS/MS鉴定,47株V.alginolyticus可产生最少6种、最多11种AHLs,产生浓度横跨nM-μM级别,在AHLs的产生种类和产生浓度上具有丰富的多样性;（3）除3-OH-C₄-HSL外,短链AHLs产生浓度均较低,长链AHLs产生浓度在不同菌株之间差异性较大;（4）C₈-HSL、3-oxo-C₈-HSL和3-OH-C₁₄-HSL未能在待测菌中被检测到,提示V.alginolyticus可能不产生上述AHLs;（5）3-oxo-C₁₀-HSL是V.alginolyticus产生的最优势AHL,产生的最高浓度超过5μM,且菌株间具有显著的差异性。（三）利用廉价的原料和普通实验室具备的一般化学合成环境,短时间内成功合成了V.alginolyticus重要QS信号分子3-oxo-C₆-HSL、3-oxo-C₁₀-HSL和C₁₂-HSL,且合成的AHLs能够使相应生物敏感菌株的菌落颜色产生颜色变化,变化强弱趋势与交叉共培养时间、AHLs浓度均呈正相关,证实其生物活性良好。（四）V.alginolyticus生物膜形成规律及不同因素对其生物膜形成的影响如下:（1）大部分环境分离V.alginolyticus的生物膜形成能力较弱;在菌株定殖12 h后生物膜基质的合成变活跃,60 h时到达顶峰,84 h后进入崩解阶段;（2）较低温度（16℃）可提高V.alginolyticus形成生物膜的能力,高温抑制其生物膜形成;（3）盐度对V.alginolyticus生物膜形成的影响受温度调控,较低温度、高盐环境下V.alginolyticus形成生物膜的能力增强;（4）3-oxo-C₁₀-HSL参与调控V.alginolyticus生物膜形成,其调控模式具有双向性,即环境中总3-oxo-C₁₀-HSL浓度处于中等水平时,V.alginolyticus生物膜形成显著增强,低浓度或高浓度3-oxo-C₁₀-HSL不会增强其生物膜形成,甚至会抑制此进程的发生,提示可能与QS的回馈机制密切相关。研究结论:（1）建立了一种改良型LAMP方法,具有良好的灵敏度和特异性,可实施现场及实验室环境下针对V.alginolyticus病原菌的快速诊断;（2）系统检测了V.alginolyticus QS信号分子产生谱,明确其产生多样性及主要优势AHL;（3）建立了一种廉价易制取的人工合成AHLs的方法,获得的3-oxo-C₆-HSL、3-oxo-C₁₀-HSL和C₁₂-HSL具有良好的生物活性;（4）明确3-oxo-C₁₀-HSL参与调控V.alginolyticus生物膜形成过程,温度、盐度等环境因素是其作用的重要影响因素。研究意义:本研究填补了国内外针对V.alginolyticus快速诊断及鉴定的技术空白,首次系统研究V.alginolyticus QS信号分子产生谱,明确V.alginolyticus的主要优势AHLs,并成功对其进行人工化学合成,突破了自然环境下AHLs产生量少,难以纯化分离的制约。在此基础上,本研究重点阐明了3-oxo-C₁₀-HSL在调控V.alginolyticus生物膜形成过程中的关键作用,揭示QS系统与V.alginolyticus生物学功能之间的密切关系,为今后研究V.alginolyticus相关致病机制提供了重要思路。