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从1982年幽门螺杆菌(Helicobater pylori，H.pylori，Hp)发现到现在，人们对Hp的认识日渐深入。研究表明Hp是世界上感染率最高的细菌之一，是慢性胃炎和消化性溃疡的重要致病因子，也与胃癌和胃粘膜相关样淋巴组织淋巴瘤(MALT)有一定的关系。1994年，世界卫生组织正式将Hp列为人类的Ⅰ类致癌剂(Group Ⅰ carcinogen)，美国疾病控制和预防中心也将Hp感染性疾病列为近年新出现的传染病。 Hp的感染是个全球性的问题。在发达国家，50％的成年人感染该菌；在发展中国家，几乎80-100％的成年人感染该菌，儿童感染的比例也很高。50％以上的感染者胃部可发生不同程度的慢性炎症；10～15％可发生消化性溃疡；极少数可发生胃部恶性肿瘤。目前对Hp的诊断及药物治疗效果并不理想，存在价格昂贵，副作用大，不易被病人接受等局限。疫苗接种是预防和控制Hp感染的有效方法，而一种理想疫苗的研制成功关键在于有效保护性抗原的确定。 鞭毛是Hp定植及感染持续存在的重要条件之一。除参与Hp在局部定植及感染延续外，鞭毛还诱导促炎细胞因子分泌及增强Hp感染部位的炎症反应。有实验表明fla基因是所有Hp共同具有的基因且十分保守，其编码的鞭毛蛋白，不仅对Hp的致病机制是十分必要的，且具有免疫原性和免疫反应性。鉴于Hp感染的普遍性，以及鞭毛基因的特点，克隆和表达fal基因，对构建Hp fla基因工程疫苗和从根本上防止Hp的感染有重要意义。作者采用基因克隆技术，将来自一临床分离Hp MEL-HP27的fla(flaA1533bp、flaB1545bp)基因全长进行PCR扩增，并与克隆载体pNEB193进行连接，制备重组质粒，然后导入大肠杆菌TB1中，用蓝白实验初步筛选可疑阳性克隆。可疑阳性克隆进一步进行特异PCR和酶切鉴定后对插入片断进行测序，并将测定的序列与已知序列进行同源性比较。由于flaA编码主要的鞭毛蛋白，所以将测序鉴郑州大学硕士学位论文幽门螺杆菌鞭毛基因的克隆和表达定后的.加刁基因插入表达载体pMAL一CZx中，所得的重组表达载体转化大肠杆菌TBI，筛选阳性克隆经PCR、酶切鉴定后，用异丙基一日一D一硫代半乳糖昔(IPTG)诱导其编码的蛋白表达，用SDS一PAGE、Westem一blot的方法鉴定表达产物及其免疫反应性。方法 1刀aA基因、刀“刀基因的克隆:通过PCR扩增刀刚基因、加B基因，PcR产物双酶切，使之产生粘性末端，然后在T4DNA连接酶的作用下定向连接到质粒pNEB193上的多克隆位点，并使之转化感受态细胞TBI，通过蓝白实验挑选可疑阳性克隆，然后进行特异PCR和酶切鉴定，阳性克隆命名为pNFA和pNFB。 2测序及分析对阳性重组质粒中插入的目的基因(刀刻、刀。刀)进行测序，并与报道的已知序列进行同源性比较。 3重组表达载体的构建将测序鉴定后的目的片段.刀刚基因从pNFA阳性克隆中纯化、回收，与表达载体pMAL一CZx连接，并使之转化感受态细胞TBI，通过蓝白实验挑选可疑阳性克隆，然后进行特异PCR和酶切鉴定，阳性克隆命名为pMFA。 4融合蛋白的表达和鉴定阳性重组克隆PMFA用IPTG诱导在大肠杆菌TBI中表达，表达的融合蛋白为MBP一FLA，命名为MFA。采用10%的SDS一PAGE检测融合蛋白的表达情况，然后以鼠的Hp全菌抗体血清和人的Hp阳性血清为一抗、HRP标记的羊抗鼠和羊抗人的IgG为二抗，用Westem blot检测刀酬融合蛋白的免疫反应性。结果 1幽门螺杆菌刀酬基因、刀“刀基因的克隆刀朗基因、加B基因经PCR扩增后，电泳均产生约1 .skb的目的条带。分别对目的片段和质粒进行双酶切，酶切产物纯化、回收后再连接、转化、蓝白筛选，挑选可疑阳性克隆提取重组质粒，单酶切电泳后可见约4.2kb的条带，然后进行特异PCR和双酶切鉴定，特异PCR产生约1 .skb的条带，双酶切产生约2.7kb和1.skb的两条带，与预期结果相同，说明重组质粒的制备是成功的。 2刀aA、刀口丑核昔酸序列分析对刀刚基因、刀。刀基因测序后与已知序列进行同源性比较，刀刻基因同源性为96.74%一97.39%，刀口刀基因同源性为96.38ry0~97.09%，其编码的氨基酸序列的同源性分别为98.12~98.63%、95.04一98.26%，验证了鞭毛基因的保守性。郑州大学硕士学位论文幽门螺杆菌鞭毛基因的克隆和表达 3融合蛋白的表达将测序鉴定后的刀比谈基因与表达载体pMAL一CZx连接，挑选阳性克隆进行诱导，SDS一PAGE显示含重组质粒的大肠杆菌TBI能表达出约95kDa的融和蛋白，其中含有53kDa的FlaA蛋白和42.skDa的标签蛋白(MBP)，与预期分子量大小相似。不同浓度的工PTG均能诱导融合蛋白的表达，经薄层凝胶光密度扫描测定其含量为16一25%;表达量以诱导后3h最高，占细菌总蛋白的28.5%。37℃诱导时，融合蛋白主要以包涵体的形式存在于菌体超声破碎物离心后的沉淀中，其量约占细菌总蛋白的50%左右;35℃诱导时，融合蛋白存在于菌体超声破碎物离心后的上清和沉淀中，含量分别为28.42%、34.28%。 4融合蛋白免疫性检测westem blot结果证实FlaA融合蛋白能与Hp口服免疫小鼠的血清和HP感染的人的血清结合，一方面验证了表达产物的正确性，另一方面证明了?