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目的:研究新鬼臼毒素衍生物ZM-16体外抗人源肿瘤细胞多药耐药作用及其诱导耐药肿瘤细胞凋亡的作用,初步探讨ZM-16抗肿瘤多药耐药作用机制,为抗肿瘤新药开发、研制提供理论基础。方法:1 MTT法和SRB法分别检测ZM-16对Hela、Skov3、Lovo、KB、KBv200、K562和K562/A02细胞生长的抑制活性。2以K562/A02和KBv200为研究对象,采用Giemsa染色技术、Hoechst33342/PI荧光双染技术、琼脂糖凝胶电泳技术、流式细胞技术观察了ZM-16诱导K562/A02和KBv200细胞凋亡与作用效果。3 RT-PCR法检测不同浓度ZM-16(1μM、4μM)对K562/A02细胞p53、p21、caspase-3、bcl-2、bax等凋亡相关基因以及mdr-1、topoⅡα、topoⅡβ耐药相关基因的mRNA表达的影响。4 Western-blot法和免疫细胞化学法检测不同浓度ZM-16(1μM、4μM)对K562/A02细胞P-gp表达的影响,初步分析了ZM-16抗肿瘤多药耐药的机制。5激光共聚焦检测不同浓度ZM-16(1μM、4μM)对KBv200细胞微管蛋白的影响。结果:1 MTT实验发现ZM-16对多种贴壁肿瘤细胞均有较强的抑制作用,IC50为0.43～20.95μM。从SRB结果可看出:ZM-16对人红白血病细胞(K562)及阿霉素诱导的多药耐药株(K562/A02)均有抑制作用,GI50分别为:4.39μM和2.28μM。通过对K562/A02细胞生长曲线的观察,发现不同浓度的ZM-16对K562/A02细胞的生长有明显的抑制作用,并且具有显著的量效关系。2 ZM-16能够诱导K562/A02和KBv200细胞凋亡。不同浓度的ZM-16 (1μM、4μM)作用于K562/A02细胞24h后,分别用Giemsa染液和荧光染料Hoechst 33342/PI对细胞进行染色,前者将细胞核染成粉红色,胞浆染成蓝紫色。未加药组的细胞核染色均一、结构完整、核浆比值大;给药组细胞呈现核膜皱缩,核固缩、边集、碎裂。经荧光双染后的细胞在紫外光激发下发蓝色和红色荧光,ZM-16可使细胞核染色质发生聚集、碎裂,细胞膜不断出芽、脱落,细胞变成数个大小不等的凋亡小体,并且随着ZM-16浓度的加大,镜下具有这种细胞形态变化的细胞数量愈加明显,凋亡细胞的比例逐渐增加。在DNA凝胶电泳实验中,用不同浓度的ZM-16分别作用于KBv200细胞24h,提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳,可呈现典型的“DNA梯子样”图谱。应用流式细胞仪进行肿瘤细胞凋亡率测定,可见经不同浓度的ZM-16(1μM、4μM)作用于K562/A02细胞24h后,出现一个明显“亚二倍体峰”,即凋亡峰,且凋亡细胞的比例随着ZM-16浓度的升高而增加,呈一定的剂量依赖性。3用不同浓度的ZM-16分别作用于K562/A02细胞6h和24h,短时间低剂量可使细胞周期阻断在S期,延长作用时间及增加给药浓度细胞被阻滞于G2/M期。4 RT-PCR结果显示1μM、4μM ZM-16能升高p53、p21、caspase-3 mRNA的水平,同时降低bcl-2、mdr-1 mRNA的水平,与对照组相比差异有统计学意义,但对bax、topoⅡα、topoⅡβ作用不明显。5经不同浓度的ZM-16(1μM、4μM)作用于K562/A02细胞48h,Western-blot及免疫细胞化学结果显示ZM-16可下调P-gp表达,且呈一定的剂量依赖性,Western-blot结果中高剂量组与阴性对照组相比P<0.01。6不同浓度的ZM-16(1μM、4μM)作用于KBv200细胞6h后,通过微管免疫荧光法观察ZM-16对微管以及细胞核形态的影响,可见对照组的KBv200细胞,微管形态结构完整,网状结构清晰,细胞核结构完好;而用1μM ZM-16处理后微管结构受到一定程度的破坏,数量减少,呈断片状,细胞核完整性受到一定影响;高剂量4μM的ZM-16则使绝大部分微管结构破坏,微管不再成束,仅在核周残留少量弥散点状不规则荧光,细胞核内部结构无法呈现。阳性对照药鬼臼毒素(1μM)处理后的细胞微管不再成束,呈现更明显的点状不规则荧光。高剂量ZM-16处理后的细胞微管形态变化与鬼臼毒素处理后结果相似。结论: ZM-16结构新颖、体外抑瘤效果明显,而且对多药耐药肿瘤细胞也有明显抑制作用;能将肿瘤细胞生长周期阻断在G2/M期,同时通过影响p53、p21、caspase-3、bcl-2、mdr-1 mRNA及P-gp蛋白水平,抑制细胞微管聚合,影响纺锤体形成来阻止细胞有丝分裂,从而诱导耐药肿瘤细胞的凋亡。因此,ZM-16有望成为一个有自主知识产权的新型抗肿瘤多药耐药化合物。