毕赤酵母鼠李糖代谢途径及鼠李糖诱导型启动子挖掘

来源 :哈尔滨师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:guokaiyan
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随着需求的增加,来源于天然菌株的目标蛋白(如食品酶、环保酶、生物医药用酶)产量已严重不能满足实际需要,改造生产菌株乃至构建生物表达系统来高效生产外源蛋白已成为目前酶工程研究热点。目前,众多生物表达系统被用于外源蛋白的高效生产,其中毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统因操作简单、易培养、生长周期短、蛋白表达量高等诸多优点,成为目前应用最广泛的外源蛋白表达系统。在毕赤酵母表达载体中,应用最广泛的启动子是甲醇诱导型强启动子PAOX1及组成型强启动子 PGAP。其中,诱导型启动子 PAOX1的弊端在于以甲醇为诱导剂,甲醇属易燃物,在大规模发酵过程中,使用及存放都存在大型安全隐患;甲醇为有毒物,不能用于食品酶、生物医药等安全性要求极高的重组蛋白的生产。而 PGAP启动子使目的蛋白在整个发酵期间持续表达,难以精准控制蛋白表达时序性;当目的蛋白对宿主细胞生长有损害时,则无法大量生产目的蛋白。因此,挖掘以无毒物质为诱导剂的诱导型强启动子是目前完善毕赤酵母表达系统的有效途径。  在本研究中,预测了毕赤酵母中4个鼠李糖代谢相关基因 PAS_chr_0338、PAS_chr_0339、PAS_chr_0340、LRA4(PAS_chr_0341)以及已被基因注释为 L-鼠李糖脱水酶基因 LRA3(PAS_chr_0075),并确定了5个基因在基因组上的位置关系,其中PAS_chr_0338、PAS_chr_0339、PAS_chr_0340、LRA4毗邻,而LRA3独立存在。实验结果证实,5个基因的转录水平在鼠李糖诱导下明显提高;而在葡萄糖为碳源进行培养时,则明显降低。这表明,5个基因的表达是受鼠李糖诱导且受葡萄糖抑制的。通过氨基酸序列比对分析及基因破坏回补实验,证明LRA4是一种醛缩酶基因,参与鼠李糖代谢。此外,以鼠李糖为诱导剂时,LRA3和LRA4的启动子(P0075启动子和P0341启动子)可有效启动报告基因lacB和gfp的表达,暗示了这两个启动子可用于安全性要求很高的食品级和医药级重组蛋白的高效生产。
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