骨质疏松症是一种先天性或继发性的代谢紊乱性疾病。全球有超过2亿女性患有骨质疏松症,这些患者会因骨脆性增加而罹患骨折的风险增高。骨质疏松症的本质原因是成骨细胞骨合成速率小于破骨细胞骨吸收的速率。研究表明,生物活性肽既可以作为骨质疏松症的治疗药物,还可以作为促进骨合成作用的功能性食品。牡蛎活性肽是海洋天然产物的重要研究成分,国内外对牡蛎肽的酶解制备、分离纯化以及生物活性方面具有广泛的研究。而且牡蛎的成壳机制与哺乳动物的骨生成机制的生物学信号通路上具有一定的相似性,然而牡蛎肽相关功能性食品在促进骨生成作用的研究却较为缺乏。因此,本研究旨在从牡蛎蛋白中筛选出具有骨生成作用的活性肽并阐明其调控机制。本研究从模拟胃肠道消化长牡蛎蛋白,得到了长牡蛎水解物和长牡蛎肽。通过水解度测定、分子排阻和SDS-PAGE分析了长牡蛎蛋白的消化情况。使用UPLC-Q-TOF联合CESI-Q-TOF对长牡蛎肽序列进行鉴定,总共鉴定到肽序列1908条,提高了单一方法鉴定肽序列的数量。为了初筛长牡蛎活性肽,通过MTT法测定了肠道模拟消化1-4h中长牡蛎水解物和以3000Da为界限的肽组分对成骨细胞增殖活力的影响,并测定了其对成骨细胞分泌的碱性磷酸酶活性的影响,最终确定了长牡蛎模拟小肠消化3 h的水解物对成骨细胞增值率最高达到168%;来源于模拟小肠消化3 h且小于3000 Da的肽类具有促骨生成活性,促进成骨细胞增值率达到135%。然后使用分子对接方法,从1908条肽段中预测出具有与成骨细胞增殖相关受体结合能力最强的4条肽段。最终确认肽P-CG-01对成骨细胞前MC3T3-E1增殖的影响最强。100 nM的P-CG-01显著促进了 MC3T3-E1细胞增殖,且碱性磷酸酶活性增加。动物实验采用去卵巢小鼠模型,考察了以3,10,30mg/kg·BW浓度的P-CG-01灌胃干预后（OVX+P3,OVX+P10,OVX+P30组）,两个月后对小鼠进行Micro-CT扫描,发现OVX+P30小鼠骨小梁的BMD值恢复到Sham组的水平。且OVX+P30组的BV/TV的比值,骨小梁分散度,以及骨小梁数量均已经恢复到了 Sham组水平。OVX+P30组小鼠血清当中ALP 比 OVX活性高,而TRAP的活性较低。此外,还测定了血清中RANKL/OPG含量的比值,OVX+P30组与OVX相比明显减少。以上结果表明肽P-CG-01对成骨细胞具有增殖作用,且对去卵巢造模的骨质疏松小鼠具有一定的促进骨骼生成作用。采用体外Transwell细胞转运模型和小鼠吸收实验研究了肽P-CG-01的吸收与转运情况,揭示出该肽可以通过小肠上皮细胞吸收进入血液循环,且在灌胃4h后血液中仍可鉴定到。在Transwell板上Caco-2细胞的上室（AP侧）加入500 μg/mL的肽后,分别于15 min,30min,60min和120min取AP侧和下室（BL侧）的培养基。随着培养时间延长到120 min时,AP侧的肽浓度已经下降为193.19±11.47 μg/mL,而BL侧的肽浓度已经上升到了 6.77±0.47 μg/mL。小鼠血液吸收实验表明,以30mg/kg·BW浓度灌胃小鼠。10 min之后即可在血清中鉴定到肽P-CG-01,并立即到达高峰,浓度为2.36±0.71μg/mL。该条肽可以在小鼠血液循环中4h仍可被鉴定,而到6h时基本已经消失,在12 h时已完全鉴定不到。用荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记该肽后加入培养基中培养。采用激光共聚焦显微镜对肽处理成骨细胞后进行定位分析,证明该肽在成骨细胞胞浆中大量存在,表明肽P-CG-01可以跨过成骨细胞膜进入胞内发挥作用。最后通过优化分子模拟算法CDOCKER、Gold、LibDock,预测了肽P-CG-01分别与整合素α5β1（PDB ID:3VI4）,甲状腺胖激素受体（PTHrP）的结合情况。然后采用逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）定量分析ERK1/2,p38,ALP,RUNX2,BMP2,OCN,OPN等细胞增值或分化相关基因的表达情况。与对照组相比,BMP2的表达增加了 3.8倍。ERK2基因调控了约1.4倍,p38的表达与内参相比负向调控了 0.5倍,ALP和RUNX2基因调控了约2倍,BMP2基因表达与内参相比增长了 3.5倍,OCN和OPN也相继正向调控了约2倍和1.8倍。此外,采用了 Western Blot蛋白印迹分析了 ERK1/2,JNK1/2,BMP2和RUNX2等蛋白水平的表达。BMP2和RUNX2在100 nM的肽处理后,也表现出了表达量增高的显著趋势。表明肽P-CG-01主要是提高了 MAPK通路中的ERK或JNK的表达,从而使细胞进入增殖与分化的周期,进而通过增加BMP2的表达量来促进成骨细胞的对骨形态的改善。因此,P-CG-01可以促进成骨细胞的骨生成活性,抑制小鼠卵巢缺失后骨质疏松症的发生和发展。