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背景及目的宫内生长迟缓(Intrauterine growth retardation,IUGR)是指胎儿在宫内生长减缓,偏离预期的生长速率,最后出生体重明显降低,常低于相应孕周胎儿平均体重的第10百分位或平均体重两个标准差,也属于小于胎龄儿(Small for gestational age,SGA)。引起IUGR的原因比较复杂,有母亲的因素,如营养不良;有子宫胎盘的因素;有胎儿本身疾病的因素。其中宫内不良环境引起IUGR占重要地位。IUGR的发生率在早产儿中远高于足月儿。据世卫组织统计,每一年全世界出生约1200万的早产儿,我国每年约有150万早产儿,占全球的10%以上。因此我国在防治早产儿IUGR相关疾病或并发症等领域面临着较大的挑战大量流行病学数据及动物实验研究表明,生命早期所处的不良环境对生命个体产生的打击不仅对围产期会发生影响,还会对成年后的健康产生长期乃至终生影响。此即成人疾病的胎儿起源假说(Barker假说)和发育起源的健康和疾病学说(Development origin of health and disease,DOHaD)。这涉及表观遗传学调控机制。表观遗传学(Epigenetics)是一门研究不涉及DNA序列变化的基因或者蛋白表达的改变,且这些改变可以在细胞增殖和发化过程中稳定遗传的学科。近年来,国内外研究涉及的表观遗传内容包括:DNA甲基化,组蛋白修饰,染色质重塑,基因沉默和RNA编辑等。目前,非常多的研究证据显示,IUGR引起成年期发生缺氧性肺动脉高压的机率增加,肺微小动脉重构,平滑肌细胞功能失调。目前的实验研究主要涉及的与此疾病发生相关的表观调控机制:内皮细胞的DNA甲基化异常,组蛋白乙酰化改变及非编码RNA的调控。对于致肺动脉高压的经典途径-肺动脉平滑肌细胞上电压依赖性钾离子通道的表达和功能改变,目前研究认为微小RNA调控起到了非常重要的作用。鉴于以上资料,我们提出假设:宫内生长迟缓大鼠成年期发生慢性缺氧性肺动脉高压可能与肺动脉平滑肌细胞上电压依赖性钾离子通道的磷酸化修饰改变有关,并且存在相关表观遗传调控机制的改变,microRNA可能参与其中的调控。第一部分 宫内生长迟缓对肺动脉平滑肌细胞及Kv1.5磷酸化修饰的影响及其机制研究目的:近年来的人群流行病学研究及实验动物研究发现,胎儿宫内生长迟缓可引起成年期肺血管功能失调,对缺氧的敏感性增加,从而在成年期发生缺氧性肺动脉高压。前期研究发现,肺动脉平滑肌细胞上的电压依赖性钾离子通道在肺动脉高压的发生过程中起了重要的调控作用。大量研究表明离子通道的活性受其相关氨基酸磷酸化修饰的影响。本部分研究的目的是,利用IUGR大鼠模型在成年期发生慢性缺氧性肺动脉高压(Chronic hypoxic pulmonary arterial hypertension,CH-PAH)的方法,观察肺动脉血流动力学改变及病理学改变,并检测缺氧相关Kv通道的磷酸化水平,以探索Kv通道磷酸化改变在该疾病模型中产生的作用及其相关机制。方法:1.IUGR动物模型的建立:取14-16周龄正常受孕SD大鼠,随机分配至IUGR组和Control组,IUGR组在全孕期给予母鼠50%正常进食的量(饮水自由摄取),产下IUGR仔鼠后恢复正常饮食;Control组全孕期给予正常饮食,直至产下Control仔鼠。2.两组仔鼠达到12周龄后,各组随机选取部分仔鼠,进行2周低氧处理,建立PAH模型。3.肺动脉压力评估及肺动脉重构的病理学检测:经颈静脉插管法测量平均肺动脉压;用免疫组化法对肺动脉平滑肌的α-SMA染色,观察肺血管中层的改变。4.Western blotting检测相关电压依赖性钾离子通道蛋白表达水平,实时荧光定量PCR法检测相关通道的mRNA水平。5.免疫共沉淀法组织水平及免疫荧光染色检测原代细胞水平的目标钾离子通道的酪氨酸磷酸化水平。结果:1.12周大鼠缺氧2周后,IUGR组平均肺动脉收缩压比control组显著升高(26.6±2.49 mmHg vs.22.9±1.52 mmHg,P<0.05,n=8),肺微小动脉平滑肌层显著增厚(P<0.05)。2.12周大鼠缺氧2周后,肺动脉平滑肌组织中相关电压依赖性钾通道中Kv1.5蛋白和KCNA5 mRNA(KCNA5是Kv1.5的基因名)水平均较常氧组降低,且在IUGR缺氧组较control缺氧组降低更为明显(P<0.05)。3.12周大鼠缺氧2周后,肺动脉平滑肌组织和原代培养的肺动脉平滑肌细胞中Kv1.5蛋白酪氨酸磷酸化水平较常氧组升高,且IUGR缺氧组较control缺氧组升高更为明显(P<0.05)。结论:1.成功验证宫内生长迟缓大鼠成年期遭遇慢性缺氧打击后发生更为严重的肺动脉高压,肺微小动脉平滑肌中Kv1.5蛋白表达降低。2.肺微小动脉平滑肌细胞中Kv1.5蛋白酪氨酸磷酸化水平改变可能与宫内生长迟缓诱导的成年期发生更为严重的缺氧性肺动脉高压相关。第二部分 miR-206在宫内生长迟缓诱导的成年期慢性缺氧性肺动脉高压中的表观遗传机制研究目的:miRNA干扰作为表观遗传学调控的经典方式之一,广泛参与各种信号通路的转录后调控过程。我们在第一部分的研究结果中已经发现,宫内不良环境可以引起成年期个体的肺动脉平滑肌细胞对慢性缺氧敏感性增加。我们的前期研究发现miR-206可能参与其中。本部分研究旨在明确miR-206在该疾病模型中发挥作用的机制,将从表观遗传调控机制角度为临床上探寻新的诊疗手段提供新的思路。方法:1.结合前期miRNA3.0芯片分析结果,采用实时荧光定量PCR验证的方式,检测12周龄,12周龄+缺氧2周大鼠IUGR组和Control组中肺动脉平滑肌组织中miR-206的表达水平。2.采用原位杂交(FISH)的方式检测miR-206在出生第1天,3周龄,12周龄,12周龄缺氧2周大鼠IUGR组和Control组在肺动脉平滑肌组织中的表达水平。3.原代培养肺动脉平滑肌细胞,在细胞水平采用miR-206-inhibitor干预的方式,验证miR-206在肺动脉平滑肌细胞中的改变。4.采用生物信息学分析的方法构建miR-206在肺动脉平滑肌细胞中的靶向作用的分子网络图。结果:1.实时荧光定量PCR验证结果显示,miR-206在12周龄大鼠肺动脉平滑肌组织中表达IUGR组显著高于control组(P<0.05),缺氧2周后miR-206表达下降,control-hypoxia组和IUGR-hypoxia组相比无明显差异。2.原位杂交法检测结果显示,出生第1天大鼠的肺动脉平滑肌组织中,IUGR组和Control组miR-206的表达无差异;3周龄大鼠的肺动脉平滑肌组织中,IUGR组较Control组miR-206的表达升高,但无统计学差异;12周龄时IUGR组显著高于control组(P<0.05);缺氧2周后miR-206表达下降,control-hypoxia组和IUGR-hypoxia组相比无明显差异。3.原代培养12周大鼠IUGR组和control组的肺微小动脉平滑肌细胞,采用CoCl2模拟体内缺氧后,细胞增值明显增加(P<0.05).miR-206 inhibitor干预后,两组细胞增值水平均下降,且两组无显著差异。4.结合多个数据库及生物信息学分析的方法,构建miR-206参与慢性缺氧性肺动脉高压的网络图。结论:1.IUGR相关的成年期慢性缺氧性肺动脉高压以及肺动脉功能失调与肺动脉平滑肌细胞中miR-206的高表达有关,表观遗传调控机制可能参与了这一病理生理过程的发生。2.基于全基因组miRNA芯片检测及生物信息学分析结果提示,miR-206参与多种缺氧引起细胞过度增殖的信号通路,和成年期肺血管疾病密切相关。