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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种与年龄相关的以进行性记忆和认知功能障碍为特征的神经变性病。特征性病理变化表现为胆碱能神经元功能障碍、神经元和突触丢失、细胞外β-淀粉样肽(Amyloid beta, Aβ)聚集形成老年斑(senile plaques, SPs)和细胞内高度磷酸化的tau蛋白形成神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)。AD主要的神经分子病理改变是蛋白质的异常表达和加工。分子生物学的进展为揭示脑内这些蛋白质合成、运输和聚集机制提供了所需工具。本研究旨在通过姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ42/Aβ40的比例及ADDLs含量的影响,并进一步研究ADDLs和胰岛素信号转导通路的关系,探讨姜黄素神经元保护的作用机制,客观评价其疗效,为开发AD的中药防治提供理论依据。材料和方法1.采用APP/PS1双转基因小鼠及同月龄同背景的正常小鼠作为实验对象,每组12-15只。中药大、中、小剂量治疗组于3月龄对小鼠实施姜黄素灌胃治疗,罗格列酮组给予罗格列酮灌胃,1次/日,连续治疗3个月2.应用Morris水迷宫检测小鼠空间学习记忆能力,评价姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠认知功能的影响。3.运用免疫组织化学方法观察治疗前后APP/PS1双转基因小鼠海马CA1区Shank1和PSD95的变化,运用电子显微镜观察各组小鼠海马CA1区神经元和突触的改变,评价姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠突触结构和功能的影响。4.运用免疫组织化学和Western-blot方法观察APP/PS1双转基因小鼠治疗前后IDE、PS2、Aβ42、Aβ40和ADDLs的变化,判断姜黄素对Aβ级联反应的影响。5.运用免疫组织化学、Western-blot和RT-PCR方法观察APP/PS1双转基因小鼠InR、IRS-1等胰岛素信号转导通路相关蛋白的变化,判断姜黄素对胰岛素信号转导通路的影响。实验结果1.姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠行为学和学习记忆的影响在Morris水迷宫实验中,与正常对照组相比模型组小鼠的逃避潜伏期和游泳距离分别明显延长和延长(P<0.01和P<0.05)；与模型组小鼠相比,罗格列酮组和姜黄素中剂量组小鼠的逃避潜伏期明显缩短(P<0.01),姜黄素大剂量组小鼠的逃避潜伏期缩短(P<0.05),尽管如此,姜黄素大剂量组和姜黄素小剂量组与阳性药物组相比逃避潜伏期长(P<0.05)；与模型组小鼠相比,罗格列酮组、姜黄素中剂量和姜黄素大剂量组的小鼠游泳距离缩短(P<0.01和P<0.05)。2.姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠神经元以及突触相关蛋白表达的影响超微结构：电镜观察正常对照组海马CA1区神经元和神经毡内结构均正常。模型组小鼠海马CA1区神经元出现程度不等的退行性变。细胞核形态不规则,部分核内染色质浓集；胞浆内脂褐素、脂滴增多,高尔基体囊泡扩张,粗面内质网离散,多聚核糖体解聚,部分线粒体变性。神经毡内可见髓鞘变性,突触数量减少、结构异常,突触小泡聚集增多。姜黄素可使突触增加,并使上述变化有不同程度的改善。免疫组织化学染色结果：模型组海马CA1区PSD-95和Shank1阳性细胞数较正常对照组明显减少(P<0.01),罗格列酮组和姜黄素阳性细胞数较模型组增加(P<0.05)。Western blot结果：与正常对照组相比模型组PSD-95蛋白表达明显减少(P<0.01)；而与模型组相比罗格列酮组和姜黄素组蛋白表达增多(P<0.05)。3.姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠Aβ的影响免疫组织化学染色结果：模型组小鼠海马CA1区Aβ生成酶PS2阳性细胞较正常对照组明显增加(P<0.01)；罗格列酮组,姜黄素大、中、小剂量组小鼠海马CA1区PS2阳性细胞明显减少(P<0.01)。模型组小鼠海马CA1区Aβ降解酶IDE和NEP阳性细胞较正常对照组明显减少(P<0.01),与模型组相比,姜黄素中剂量组小鼠海马CA1区IDE阳性细胞增加(P<0.05)；姜黄素大、中、小剂量组小鼠海马CA1区NEP阳性细胞增加(P<0.05)。免疫组织化学染色的Aβ40和Aβ42阳性细胞计数模型组均较正常对照组小鼠阳性细胞表达明显增加,其中Aβ42阳性细胞计数增加更加明显；与模型组小鼠相比罗格列酮组和姜黄素治疗各组小鼠阳性细胞表达明显减低。模型组小鼠海马CA1区Aβ40、Aβ42、ADDLs阳性细胞平均灰度值较正常对照组明显降低(P<0.01),姜黄素中剂量组、姜黄素小剂量组阳性细胞平均灰度值同模型组相比增加(P<0.05)。Western blot结果：各蛋白表达结果与免疫组化相符。4.姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠胰岛素信号转导通路的影响免疫组织化学染色结果：与正常对照组相比,模型组小鼠海马InR、IRS-1阳性细胞计数明显增加(P<0.05和P<0.01)；与模型组相比罗格列酮组和姜黄素中剂量组InR、IRS-1阳性细胞计数增加得到改善(P<0.05和P<0.01)。与正常对照组相比,模型组小鼠海马CA1区p-IRS-1、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表达均有不同程度的降低(P<0.05或P<0.01),与模型组相比罗格列酮组和姜黄素中剂量组p-IRS-1、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白阳性细胞计数增加(P<0.05或P<0.01)。Western blot结果：各蛋白表达结果与免疫组化相符。RT-PCR结果：与正常对照组相比模型组小鼠海马InR mRNA和IRS-1 mRNA表达明显增加,罗格列酮组和姜黄素大、中、小剂量组可使其表达有不同程度的恢复。结论姜黄素保护神经元的机制是通过改善胰岛素信号转导障碍,减少Aβ42和ADDLs生成并增加其降解,影响Ap级联反应起作用的。