论文部分内容阅读
目的:代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）,既往又称非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）,是代谢综合征的肝脏表型,是以肝细胞脂肪变性和脂质沉积为主要特征的一种慢性代谢性疾病。世界范围内NAFLD的人群患病率约为25.24%,最新流行病学结果显示:2019年我国NAFLD患病率约29.8%。NAFLD的临床病理学范围包括非酒精性脂肪肝（NAFL）或单纯性脂肪肝,非酒精性脂肪性肝炎（NASH）,肝纤维化和肝硬化。棕榈酸（PA）诱导的肝细胞凋亡在NAFLD的进展中至关重要。1,4,5-三磷酸肌醇1型受体（IP3R1）是细胞内Ca2+释放通道,参与PA诱导的肝细胞凋亡。尽管NAFLD患者和PA处理的肝细胞中IP3R1蛋白的表达都表现为明显升高,但目前尚不清楚PA如何促进IP3R1的表达。因此,本研究拟探索PA处理肝细胞后IP3R1蛋白表达增加的原因,并初步探讨其分子机制。方法:第一部分:不同浓度PA处理肝细胞,进行检测线粒体膜电位、凋亡蛋白cleaved-caspase3和细胞凋亡,以确定诱导肝细胞线粒体功能障碍和细胞凋亡的最适PA浓度,并用MitoSOX染色检测了该最适PA浓度下肝细胞中超氧化物聚积情况,Fluo-4和mito-tracker荧光染色检测线粒体钙。用毒胡萝卜素抑制ER再摄取细胞内钙离子,Fluo-4标记细胞内Ca2+,酶标仪检测从ER释放的钙离子速度和数量。此外,用IP3R抑制剂2APB处理肝细胞,Fluo-4和mito-tracker荧光染色观察2APB对线粒体钙的影响;JC-1染色观察2APB对线粒体膜电位的影响;MitoSOX染色观察2APB对细胞内超氧化物聚积的影响。第二部分:PA处理肝细胞后,Western blot检测PA对IP3R1蛋白表达的影响;实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测PA对IP3R1 mRNA水平的影响;用CHX抑制肝细胞蛋白合成,Western blot观察IP3R1蛋白的降解。第三部分:PA处理肝细胞后,Western blot检测IP3R1蛋白Tyr353位点的磷酸化,fyn的表达水平和src的磷酸化水平;在使用src激酶家族抑制剂su6656后,Western blot检测su6656对IP3R1蛋白Tyr353位点磷酸化的影响;联合使用CHX观察su6656对IP3R1蛋白稳定性的影响;Fluo-4和mito-tracker荧光染色观察su6656对线粒体钙的影响;JC-1染色观察su6656对线粒体膜电位的影响;MitoSOX染色观察su6656对细胞内超氧化物聚积的影响。结果:第一部分:JC-1染色结果显示,肝细胞的线粒体膜电位随着PA浓度的升高而逐渐降低;Western blot和流式测凋亡结果显示,肝细胞凋亡随着PA浓度升高而增加,并且在0.8mM PA处理下,肝细胞产生的效应最为显著。与Ctrl组相比,MitoSOX染色结果显示,PA组红色荧光明显增强（P<0.001）,Ca2+和线粒体共定位所产生黄色荧光也明显增强（P<0.001）,ER释放钙离子的达峰时间明显缩短,曲线下面积明显增加（P<0.01）。在2APB处理后,与PA处理组相比,PA+2APB组Ca2+和线粒体共定位所产生黄色荧光明显减弱（P<0.001）,线粒体膜电位明显升高（P<0.001）,MitoSOX染色红色荧光明显减少（P<0.001）。第二部分:与Ctrl组相比,Western blot结果显示PA处理明显增加了IP3R1蛋白的表达（P<0.01）。RT-PCR结果显示与对照组相比,PA组IP3R1的mRNA水平仅为Ctrl组的40%左右（P<0.001）。而CHX抑制了IP3R1蛋白的合成后,Western blot结果显示PA明显减缓了IP3R1蛋白的降解（P<0.05）。第三部分:Western blot结果显示:与对照组相比,PA明显增加了IP3R1蛋白Tyr353位点的磷酸化（P<0.01）,并且增加了src的磷酸化（P<0.05）,而对fyn蛋白的表达没有明显影响。在使用了su6656后,结果显示,su6656显著降低了IP3R1蛋白稳定性（P<0.05）;并且在使用su6656后,IP3R1蛋白Tyr353位点的磷酸化也降低了（P<0.05）。与PA处理组相比,PA+su6656组钙离子和线粒体的共定位明显减少（P<0.001）;PA+su6656组升高了线粒体膜电位（P<0.001）,PA+su6656组减少了肝细胞内超氧化物聚积和肝细胞凋亡（P<0.05）。结论:PA通过激活src途径促进IP3R1的Tyr353磷酸化,引起IP3R1蛋白质稳定性的增加,从而导致肝细胞线粒体钙超载和线粒体功能障碍。我们的研究结果还表明,抑制src/IP3R1途径（如使用Su6656或2APB）可能是治疗NAFLD的一种新型潜在治疗方法。