【摘 要】
：
第一部分下调Nkx2.5重编程乳鼠心肌细胞为起搏样细胞目的:探讨腺病毒介导shRNA下调Nkx2.5是否可将乳鼠心肌细胞重编程为起搏样细胞。方法:采用胰酶和Ⅱ型胶原酶混合消化法分离1～3天的新生雄性SD乳鼠心肌细胞,随机分为对照组和实验组,实验组转染携带靶向Nkx2.5的RNA干扰序列（短发夹RNA,shRNA）和绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒Ad-Nkx2.5-shRNA-GFP,对照组转染等量
论文部分内容阅读
第一部分下调Nkx2.5重编程乳鼠心肌细胞为起搏样细胞目的:探讨腺病毒介导shRNA下调Nkx2.5是否可将乳鼠心肌细胞重编程为起搏样细胞。方法:采用胰酶和Ⅱ型胶原酶混合消化法分离1～3天的新生雄性SD乳鼠心肌细胞,随机分为对照组和实验组,实验组转染携带靶向Nkx2.5的RNA干扰序列（短发夹RNA,shRNA）和绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒Ad-Nkx2.5-shRNA-GFP,对照组转染等量的仅携带GFP的对照组腺病毒Ad-shRNA-GFP,以不同感染复数（MOI）转染细胞选取最适MOI,按最适MOI转染48h后,计数细胞搏动频率,采用实时荧光PCR和蛋白质免疫印迹检测Nkx2.5沉默效果,保证沉默效果之后,检测起搏细胞发育相关转录因子（Tbx3、Tbx18、Shox2和Isl1）mRNA水平变化以及起搏相关离子通道超极化激活环核苷酸门控通道4型（HCN4）和缝隙链接蛋白40（Cx40）mRNA和蛋白水平变化,采取免疫荧光检测HCN4蛋白的表达,转染病毒72h后胰酶消化制成细胞悬液,采用全细胞膜片钳技术检测绿色荧光细胞的If电流。结果:分离培养的原代心肌细胞48h呈现成簇搏动,α-actin检测心肌纯度达0.91±0.01,构建的病毒转染的最适MOI=20。转染病毒后,对照组实验组细胞搏动频率分别为118.8±1.3次/分和138.7±4.0次/分,实验组显示构建的病毒可显著下调Nkx2.5水平（p<0.05）;下调心肌细胞Nkx2.5水平后,起搏细胞发育相关转录因子mRNA水平明显增高（p<0.05）、HCN4表达水平明显升高（p<0.05）,心肌相关缝隙连接蛋白Cx40表达水平下降（p<0.05）。免疫荧光显示实验组离子通道HCN4表达强于对照组。腺病毒转染72h后的实验组可检测到If样内向电流,内向电流能被If电流的特异性阻滞剂氯化铯（Cs Cl）完全抑制。结论:下调乳鼠心肌细胞Nkx2.5可使起搏细胞发育相关转录因子、HCN4通道水平提升,缝隙链接蛋白Cx40水平下降,且可检测出起搏样电流If,说明下调乳鼠心肌细胞Nkx2.5水平可使其重编程为起搏样细胞。第二部分下调Nkx2.5对三度房室传导阻滞大鼠心室率的影响目的:验证局部下调Nkx2.5对三度房室传导阻滞大鼠心室率的影响。方法:20只200g雄性SD大鼠采用随机数字表法随机分为对照组（n=10）和实验组（n=10）。采用心肌局部注射方法,使用微量注射器快速注射50微升含8x108PFU对照组Ad-shRNA-GFP或实验组Ad-Nkx2.5-shRNA-GFP病毒悬液,至左室游离壁靠近心尖部,造模7天后使用Langendorff灌流装置,制备离体心脏记录离体电生理数据,采用化学消融法,注射75%乙醇消融Koch三角处房室结制备三度房室传导模型,心电图记录是否有三度房室传导阻滞出现,将刺激电极置于注射部位,进行起搏,比较心室自发搏动与和注射部位起搏波形的差异,取材做冰冻切片荧光显微镜下观察注射部位病毒转染效率并采用蛋白质免疫印迹验证Nkx2.5沉默效果。结果:两组大鼠心脏离体灌流下造模后均可出现稳定的房室分离,呈现三度房室传导阻滞,心率明显减慢。造模成功后,实验组（n=7）可见有r S型心室异位节律,心室率114.7±3.0次/分,其极性和形态与在注射部位进行电极起搏产生波形的极性和形态相同,而对照组心室率84.5±2.5次/分（n=10）,心电图所示与在注射部位进行电极起搏产生波形的极性和形态不同。取材注射部位显示病毒可高效率感染局部心肌,荧光显微镜下观察冰冻切片,可见绝大部分心肌显示绿色荧光,蛋白质免疫印迹显示实验组构建病毒可有效下调心肌细胞Nkx2.5水平。结论:下调局部心肌Nkx2.5水平可使三度房室传导阻滞大鼠心脏自身心电图与注射部位起搏心电图大体一致,可提高三度房室传导阻滞大鼠心室率。
其他文献
具有高精度的压电微动平台广泛应用于先进制造加工、生物科技、医学工程和自动化技术、纳米测量等微纳技术,是实现超精密加工、操作、检测的核心部件和关键技术。压电微动平台最常采用压电陶瓷驱动柔性铰链机构,其输出精度的主要影响因素包括:固有迟滞、蠕变现象以及柔性铰链机构轻阻尼特性引起的振动。此外,多维运动中,各轴之间交叉耦合和同步性的影响也降低了平台轮廓跟踪的精度。因此,本文以压电驱动柔性铰链机构的微动平台
目的:非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）目前已成为全球流行性疾病。随着发病率和流行率的日益上升,对疾病发生发展机制以及治疗需求,激发了针对该领域的大量研究。在本研究中,通过将Gene Expression Omnibus数据库中公布的基因组数据分析,发现干扰素调节因子6（IRF6）在由高脂肪饮食诱导的小鼠脂肪肝表达下调,提示我们肝细胞中的IRF6可能作为肝脏脂肪变性作用中的保护因子。我们推测IRF6
珞珈一号01星（LJ1-01）是全球首颗专业夜光遥感卫星,由武汉大学团队与长光卫星有限公司共同研发制作,于2018年6月2日成功发射升空。珞珈一号01星分辨率为130米,理想条件下可在15天内绘制完成全球夜光影像,提供我国及全球GDP指数、碳排放指数、城市住房空置率指数等专题产品,动态监测中国和全球宏观经济运行情况,为政府决策提供客观依据。目前国外己有两种较为成熟稳定的夜间灯光影像,包括美国的DM
非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,NASH）是由肝脏中过多的脂质积聚引起的慢性肝损伤和炎症的病症,已成为成人慢性肝病的主要原因。NASH的主要特征是肝脂肪变性、小叶炎症和肝细胞气球样伴有或不伴有肝纤维化,很可能发展为肝硬化及肝癌。NASH与肥胖、血脂异常和2型糖尿病等疾病密切相关。目前尚无美国食品及药物管理局（FDA）获批的针对NASH的有效治疗药物。
在中国城镇化加速发展进程中,城市人口不断增多,居民生活水平不断提升,城市交通系统面临的压力也越来愈大。飞速增长的机动车保有量和出行需求已经远超出过去交通基础设施的设计承载能力的范围,城市运行节奏受交通影响变慢,出行效率降低,交通事故频发,污染物排放等诸多不利影响导致了对改善交通拥堵常发的现状,增强道路通行能力,提高城市道路运输效率的迫切需求。智能交通系统（ITS）综合多种先进技术,能提供实时交通数
复合梁结构广泛应用于桥梁、建筑及航空等工程领域。在服役过程中,该类结构往往涉及屈曲失稳、突跳等非线性宏观尺度力学行为,并且其宏观结构尺度的力学行为与微观材料尺度的应力状态紧密相关、交互影响。现有的多尺度均匀化模型可模拟宏观结构、微观材料的力学状态并实时相互传递应力、应变等关键力学信息,但难以兼顾计算精度与效率。为此,本论文旨在综合运用多尺度计算均匀化方法、Carrera统一模型理论及数值渐近法,开
研究背景精子相关抗原9（sperm associated antigen 9,Spag9）也被称作c-Jun氨基末端激酶相关亮氨酸拉链蛋白（c-Jun NH2-terminal kinase-associated leucine zipper protein,JLP）,是c-Jun氨基末端激酶信号通路相关蛋白（c-Jun NH2-terminal kinase-associated interac
肿瘤内部细胞缺氧的特点明显的抑制了放疗和化疗的治疗效果,利用纳米领域的新技术,设计和建造具有缺氧响应的运载体,同时运载化疗药物和放疗增敏剂,以提高对肿瘤的治疗效果。本研究中,我们使用EDC化学和分步合成法制备了尺寸为245nm的MGO/FU-MI纳米复合材料,并使用透射电子显微镜（TEM）,动态光散射（DLS）来表征其形貌和尺寸,用光电子能谱（XPS）和电子能谱（EDS）探究其化学组成,用傅里叶红
电离层是高空大气层的重要组成部分,不仅保护着地球免受太阳紫外辐射与宇宙高能粒子的直接作用,也影响着无线电波的传播,与人类的生产生活息息相关。同时,电离层也是空间大气科学的重要研究课题,监测和研究电离层可以提高人类对电离层的形成机制的认识,掌握电离层的时空变化规律。传统大气探测手段,如无线电探空仪、气象卫星等因观测成本高,难以实现大范围、连续观测。近年来,随着以北斗、GPS、GLONASS、Gali
机器人广泛应用于人们的生产生活中,将人们从单调重复性的工作中解放出来,大大提高了生产效率和质量。然而,现阶段的机器人灵巧操作水平和智能决策能力仍远低于人类,仅能应用于结构化环境下重复性的任务操作。针对动态非结构化环境下机器人的操作,难以设计具有高适应性和稳定性的运动规划算法。针对复杂接触环境下的任务操作,其位置和力的规划与控制仍需针对特定的任务进行调试,难以推广应用于不同场景。因此,本文提出基于模