论文部分内容阅读
目的:缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)再灌注损伤(reperfusion injury)的病理生理机制十分复杂,如兴奋性氨基酸毒性作用、炎症、细胞凋亡等,其中免疫反应所导致的坏死及缺血区域的炎症性损伤成为热点,然而,抗炎治疗在脑梗死的临床研究中仍未取得理想效果。因此,寻找新的炎症因素并加以抑制可能为缺血性脑血管病的治疗带来新的突破。截至目前,我们实验团队对诸如血小板再生生长因-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)、水孔蛋白4(aquaporin-4,AQP-4)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor,IGF-1)、IL-6、TNF-α、环氧合酶-2(COX-2)、补体受体2、补体C3、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein,MCP-1)等因子在大鼠大脑缺血组织中的动态表达进行了系列研究,发现以上因子均积极参与了炎症反应过程[1-6],同时对脑心通、姜黄素、丹参酮、氧化苦参碱等中药试剂加以筛选,试图寻找有效抑制炎症反应的药物,观察到一定效果,但是炎症因子数量诸多,相互之间作用复杂,以及许多病理生理机制仍未阐明,故仍需进一步深入研究,诸多研究内容已于国内外期刊发表[7]。本次实验为系列研究之一。OX40L是共刺激分子的一员。该分子系肿瘤坏死因子超家族的新成员,是OX40的天然配体,表达于树突状细胞、小胶质细胞、B细胞、T细胞及血管内皮细胞以及某些组织器官包括心、骨骼肌、睾丸和肺,有较广泛的生物学活性,包括促进树突状细胞的分化成熟,增强T细胞功能,促进细胞的粘附作用,参与炎症反应,调节免疫等。最新研究主要集中于动脉粥样硬化、急性冠脉综合征等,因此,研究缺血再灌注模型脑组织OX40L的表达或许可以进一步阐明缺血再灌注的损伤机制,并为临床缺血性脑血管病再灌注损伤提出可能的治疗位点。本实验参照Koizumi线栓法并结合本实验室经验建立大脑中动脉缺血再灌注(middle cerebral artery reperfusion,MCAR)模型,应用免疫组织化学技术和western blot测定缺血再灌注后大鼠大脑组织OX40L的动态表达及缺血再灌注后脑梗死体积的变化,旨在探讨缺血再灌注模型大鼠大脑组织OX40L的表达和其意义。方法:1模型的制备本实验参照Koizumi [8]线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注(middle cerebral artery reperfusion,MCAR)模型。我们实验室依据前期实验认为,本模型优点在于[9]:①无需开颅,属相对非侵入的方法②可实现缺血后再灌注。同时,我们也发现该实验具有一定的缺点[9]:①动物体质量要求严格,一般250 -300 g;②插入线拴可能影响下丘脑体温调节中枢的血液循环,造成缺血后体温升高,影响缺血结果;③需要一定的手术技巧;④模型实质是栓塞性卒中,与人群常见卒中存在差异。因此,我们实验室在参照Koizumi方法的基础上,密切观察并控制以下方面:①保持室温在26℃,室温过低使大鼠难于苏醒,甚至迅速死亡;②插线应缓慢分多次拔出,否则,再灌注血流过大,引起动物缺血区出血等损伤,使动物死亡率升高;③分离血管要彻底,勿把与颈外动脉(external carotid artery,ECA)并行的神经结扎,减少对颈动脉分叉下的交感神经节损伤,胸骨甲状肌和胸骨舌骨肌覆盖的气管的过度刺激,导致大鼠术中死亡;④插入线拴速度尽可能快,避免时间长了血管内血栓形成;⑤术后补足手术丢失的体液;⑥保证动物营养,尤其术后,将饲料磨制成粉状物以置于饲养笼内;⑦避免过度刺激大鼠,减少其应激状态;⑧避免动物麻醉的二次注射和影响模型的评分及减少其脑保护作用;⑨模型评分最好于实验动物苏醒后半小时内进行。2采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为2组:假手术(sham)组、MCAR组。根据时间点分为6 h、24 h、48 h、72 h、96 h五个亚组。应用Koizumi等的线栓法建立大鼠MCAR模型,并至相应时间点断头处死实验动物。假手术组除不插线栓外其余操作同MCAR组。3应用免疫组织化学检测脑组织免疫阳性细胞数,TTC染色测定脑梗死体积,western blot测定OX40L的表达水平。结果:1脑梗死体积测定:TTC染色显示:sham组脑组织均匀红染无梗死灶,MCAR组可见大面积白色梗死灶,多位于右侧基底节、顶区和颞区皮质。脑梗死体积测定显示:MCAR组与sham组有统计学意义(P<0.05),动物模型符合实验要求;2脑组织免疫阳性细胞数:脑组织免疫阳性细胞结果显示:MCAR组各亚组6 h、24 h、48 h、72 h、96 h OX40L未见小胶质细胞免疫阳性者。3.脑组织western blot测定OX40L:结果显示各组经western blot测定未见OX40L表达。结论:动物模型制作符合实验要求,缺血性脑血管病再灌注损伤后OX40L的表达测定结果提示其可能与缺血再灌注损伤无必然联系,但仍需进一步研究。