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研究背景:干细胞作为一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体,能进一步分化成为多种类型的细胞,构成机体各种复杂的组织和器官。以干细胞治疗为核心的再生医学,将成为继药物治疗、手术治疗后的另一种疾病治疗途径,从而成为新医学革命的核心。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是应用较多的一类具有多向分化能力的成体干细胞。利用回收的胎盘羊膜组织分离冷冻保存其富含的间充质干细胞,完善干细胞库储备,对于科学研究、临床利用干细胞资源治疗有着重要意义。 目的:本研究旨在分离、培养人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs),并进行体外长期传代培养,通过细胞形态、膜表面标志以及分化特性进行鉴定,同时对遗传稳定性和致瘤性进行研究,从而观察该细胞是否能长期保持间充质干细胞的特性,为人羊膜间充质干细胞的储备和临床应用提供实验依据。 方法:无菌条件下从新鲜人胎盘组织分离出羊膜,采用组织贴壁法和酶消化法在37℃、5%CO2下进行原代细胞分离培养,对不同代数的细胞经流式细胞技术检测其膜表面标志物;并通过将其向神经细胞、成骨细胞和肝细胞样细胞进行诱导分化,观察其分化能力;采用染色体G显带法制备和分析传代细胞染色体核型;通过裸鼠致瘤实验观察hAMSCs的致瘤性。 结果:体外传代培养的hAMSCs形态似长梭型,呈流水状生长,细胞活性高,冻存复苏后仍能保持正常形态,并可在体外稳定扩增,细胞生长曲线呈“S”型;CD90、CD73、CD44、CD105的表达量分别是94.6%、92.3%、94.7%和91.2%,而CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR表达量是0.6%,符合间充质干细胞的生物学特性;而在分化实验的过程中,利用β-巯基乙醇、丁羟基茴香醚向神经细胞诱导,细胞出现多个神经轴突,神经元特异性烯醇化酶检测,DAB染色呈黄色;利用β-甘油磷酸钠、维C和地塞米松向成骨细胞诱导,细胞形成矿化结节,茜素红染色呈红色;利用肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子以及制瘤素等向肝细胞样细胞诱导,甲胎蛋白检测,DAB染色呈黄色;P3-P10代的hAMSCs细胞染色体核型分析显示均为正常二倍体核型,未见易位、缺失、重复等异常改变;裸鼠经皮下注射hAMSCs后,一般状况良好,注射部位皮肤未见肿瘤形成,各器官组织切片结果与正常对照组无区别,未见异常改变。 结论:人胎盘羊膜组织中富含间充质干细胞,且该细胞可在体外稳定扩增培养,10代以内具有间充质干细胞的特性和分化能力,未见染色体核型改变,接种于裸鼠皮下后未见肿瘤形成。本研究为hAMSCs成为干细胞库和细胞治疗的可靠来源提供了实验依据。