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MicroRNA（miRNA）是一种大小约21～23个碱基的单链小分子RNA，它由DNA非编码区域转录，在进化中高度保守，其表达既具有时空特异性，也具有组织和细胞特异性。miRNAs通过与mRNA的3端UTR序列互补而抑制其翻译，因而广泛的参与细胞的生长、分化、发育等生理病理过程。随着对miRNA认识的不断深入，发现miRNA在神经系统的损伤过程中也起到了至关重要的作用。细胞凋亡是神经损伤的重要形式，已有研究表明miRNA参与神经细胞的凋亡过程，Chen等发现miR-21在人类恶性脑胶质瘤中普遍高表达，通过抑制miR-21的表达胶质瘤细胞凋亡明显增多，李朝辉等利用过氧化氢诱导PC12细胞模型，检测到凋亡前后多个miRNA表达谱都发生了变化。 本实验室前期通过miRNA芯片技术发现骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)向神经细胞分化后，miRNAs的表达谱发生明显改变，其中miR-29a的表达量较分化前增高最为明显。之后通过慢病毒介导miR-29a在大鼠骨髓间充质干细胞中高表达，发现miR-29a有促进骨髓间充质干细胞的凋亡及抑制其增殖的作用[1]。也有研究表明，miR-29a靶向DNMT1，DNMT3a，DNMT3b，Mcl-1，YY1andCDK6[2-4]促进凋亡，它们也是依赖p53的方式诱导细胞凋亡。我们利用生物信息学技术，发现冷休克蛋白(Cold-ShockDead-boxproteinA，CSDA)也可能是miR-29a靶基因，从而调节细胞的凋亡，但目前尚未有实验证实。 在环境温度发生明显改变时，生物体会产生某种蛋白来调节机体功能，以适应温度变化。比如，在环境温度降低时机体会在低温的刺激下产生一些蛋白来适应环境变化，该类蛋白统称为“冷休克蛋白”(coldshockproteins，CSPs)[5]。迄今为止，CSPs已经在微生物、植物及动物细胞中发现，而且已证实CSPs在核酸结构以及蛋白质结构上具有较高的同源性，且高度保守[6]。冷休克蛋白CSDA是DeadBox蛋白家族中非常重要的一种蛋白，常温下表达量极低，而在低温时大量表达，具有RNA酶解旋活性，是核糖体结合蛋白，其功能与细胞增殖、分化、凋亡有关。 PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株，具有神经内分泌细胞的一般特征，被广泛应用于神经生理和神经药理学研究。本研究以慢病毒介导miR-29a前体在PC12细胞中高表达，通过H2O2诱导PC12凋亡为模型，探索mir-29a靶向CSDA基因促进细胞凋亡的作用，进一步丰富mir-29a促进神经细胞凋亡的理论。 目的： 建立高感染效率、稳定的过表达miR-29a的PC12细胞株，探索miR-29a靶向CSDA基因促进细胞凋亡的作用，进一步丰富miR-29a促进神经细胞凋亡的理论。 方法： 1.慢病毒的包装。293T细胞复苏和扩增，按照复能基因的慢病毒包装试剂的操作步骤，分别包装miR-29a前体表达病毒载体(Lvx-miR-29a-eGFP)、空白对照载体(Lvx-eGFP-control)，48h收获病毒上清。 2.慢病毒感染PC12细胞及抗性筛选。感染前一天传代PC12细胞至6孔板，加入200μl的病毒上清感染PC12细胞，48h后加入抗性培养基进行两周的筛选。 3.实验分组:miR-29a过表达组，空质粒对照组，200μmol/LH2O2+miR-29a过表达组，200μmol/LH2O2+空质粒对照组，200μmol/LH2O2+空白对照组。 4.流式细胞术检测各组细胞凋亡的变化，H2O2诱导PC12细胞10h后检测各组细胞的凋亡率。 5.提取各组细胞的RNA，反转录为cDNA，real-timePCR检测预测miR-29a调控靶基因表达的变化。提取各组细胞的蛋白，Westernblot检测相应靶蛋白的变化。 6.统计学分析。采用SPSS12.0统计软件进行分析。独立实验重复3次，数值用样本均数±标准差（(X)±S）表示，采用独立样本t检验比较两组间差异，以α=0.05为检验标准。 结果： 1.慢病毒包装。293T细胞贴壁呈类圆形或多角形，排列整齐。包装后48h收获Lvx-miR-29a-eGFP和Lvx-eGFP-control病毒上清。 2.感染PC12细胞及抗性筛选。在病毒感染后的PC12细胞状态略差，加入筛选培养基后未被病毒感染的细胞大量死亡，一周后存活的细胞开始形成克隆，筛选两周后形成稳定的细胞系，分别命名两组细胞PC12-miR-29a，PC12-eGFP，流式细胞术检测感染率miR-29a过表达组为75.2％，空质粒对照组为69.8％。 3.流式细胞术检测各组细胞的凋亡率，miR-29a过表达组凋亡率3.267±0.551％，空质粒对照组1.867±0.203％，miR-29a过表达促进PC12细胞凋亡(P＜0.05);200μmol/LH2O2+miR-29a过表达组的凋亡率为41.2±3.54％，300μmol/LH2O2+空质粒对照组12.77±0.35％，200μmol/LH2O2+空白对照组13.59±1.83％，在H2O2的诱导下空质粒对照组与空白对照组凋亡率的差异没有统计学意义(P＞0.05)，而与空质粒组相比，miR-29a过表达时经过H2O2诱导后PC12细胞的凋亡率显著增加(P＜0.001)。 4.通过RT-qPCR检测miR-29a下游靶基因，用相对定量的方法（2-ΔΔCt）计算miR-29a过表达组与空质粒对照组靶基因表达的的差异，miR-29a过表达时CSDA表达量下降(miR-29a过表达组是空质粒对照组0.829倍，P＜0.001)，而Notch1，adam19，zfp91的表达量均升高（分别是miR-29a过表达组是空质粒对照组1.235倍，1.474倍，1.835倍，P＜0.001）。 5.当200μmol/LH2O2诱导10h后，各组CSDA表达量与相对应的未加H2O2组比较均显著降低，其中H2O2+miR-29a过表达组CSDA是miR-29a过表达组的0.52倍，P＜0.001，H2O2+空质粒对照组为0.67倍;在H2O2诱导凋亡后miR-29a过表达组CSDA表达量下降程度高于空质粒对照组（0.90倍，p＜0.05）。 6.WesternBlot结果显示，H2O2诱导10h后，CSDA蛋白的表达量与H2O2阴性组相比明显下降;而过表达miR-29a是CSDA蛋白的表达量与空质粒对照组相比也显著降低。 结论： 1.miR-29a靶向抑制CSDA在PC12细胞中的表达，并促进细胞凋亡。 2.H2O2能够显著抑制CSDA在PC12细胞中的表达。 3.过表达miR-29a可显著降低PC12细胞对氧化应激的抵抗性，增强H2O2的促进凋亡作用。