论文部分内容阅读
十字花科黑腐病菌(Xanthomonascampestrispv.campestris，Xcc)是全球十字花科植物黑腐病的病原菌。Xcc不但是一种重要的植物病原菌，它还因能够生产应用价值高的胞外多糖(extracellularpolysaccharide，EPS)，又称黄原胶，而为人们熟知。糖代谢对于Xcc的致病性和EPS合成都至关重要。基因组注释表明Xcc8004拥有EDP(Entner-Doudoroffpathway)、EMP(EmbdenMeyerhofpathway)、PPP(pentosephosphatepathway)和糖异生途径等多条糖代谢途径所需的基因，其中有些基因已经得到较为深入的阐述。根据Xcc8004基因组的注释，XC0872、XC0979和XC0976被预测为EMP途径中的基因，分别编码6-磷酸果糖激酶、1，6-二磷酸果糖醛缩酶和磷酸甘油酸激酶；XC1974和XC1973被注释为EDP中的两个重要基因，分别编码6-磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶。本工作以同源双交换的方法构建了上述基因的缺失突变体，分别命名为DM0872、DM0979、DM0976、DM1974和DM1973，并对这些突变体进行表型检测。在以葡萄糖或果糖为唯一碳源的基本培养基中培养时，DM0872形成的菌落大小跟野生型相似。以含葡萄糖、果糖、半乳糖或甘油的NY培养基进行EPS产量定性检测，结果表明XC0872缺失后不影响EPS合成。在寄主萝卜中进行致病性检测，结果显示XC0872缺失后并不影响其致病性。XC0872被注释为6-磷酸果糖激酶，但是有文献报道在Xcc中没有检测出6-磷酸果糖激酶活性。本实验用RT-PCR的方法对XC0872进行转录分析，实验结果显示XC0872在Xcc中是转录的，说明6-磷酸果糖激酶失活的原因不发生在转录水平。在以葡萄糖或果糖作为唯一碳源的基本培养基中，DM0976、DM1974和DM1973都无法维持生长，但是DM0872和DM0979仍然生长。该结果表明XC0976、XC1974和XC1973为葡萄糖和果糖代谢所必需。在所检测的C3或C4化合物为唯一碳源的基本培养基中DM0976和DM0979均无法生长，其互补菌与野生型菌株能够生长，表明XC0976和XC0979都是糖异生途径所必需的。在葡萄糖或者丙酮酸为唯一碳源的基本培养基中，DM0976都无法生长；然而在葡萄糖和丙酮酸混合的基本培养基中，DM0976能够生长。我们认为该结果能够很好地解释为何在丰富培养基中DM0976和其它突变体都能较好地生长。在半乳糖为唯一碳源的固体基本培养基中，DM0979和DM0976的菌落都明显变小，而其互补菌的菌落大小能恢复与野生型的程度。这表明XC0976和XC0979与半乳糖的利用相关。在葡萄糖或果糖培养基中，DM1974和DM1973的EPS合成产量下降了60％左右。我们推测XC1974和XC1973突变后，EDP途径受阻，Xcc无法获得足够的能量供给EPS合成，因此产量下降。XC0976也是完整的EDP途径所需要的，但它的突变体DM0976在利用葡萄糖和果糖生产EPS的产量与野生型相比没有明显变化。我们推测这与DM0976能在多种碳源的培养基中生长良好有关。在以半乳糖平板定性检测突变体的EPS产量时，发现DM0979形成的菌落明显比野生型菌落小，其互补菌能恢复野生型的水平，表明XC0979与在半乳糖培养基中的EPS合成相关。在宿主满身红萝卜中对DM0872、DM0979、DM0976、DM1974和DM1973进行致病性检测，发现只有DM0979的致病性比野生型菌株有明显降低，其互补菌能恢复野生型的致病力水平。该结果表明XC0979与致病性相关。