美洲黑杨(Populus deltoides Marsh.)属于杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus),分布范围广,而且优良杨树品种多数含有美洲黑杨成分,因此美洲黑杨在杨树遗传育种中占有主要地位。但由于杨树的许多性状受多基因调控,杂合度高,且生长周期长,使得利用常规育种进行林木遗传改良变得非常困难;此外,转基因植株可能对非目标生物和环境产生潜在的影响;另外,作为绿化树种和转基因受体材料,却又存在花粉过敏及基因逃逸等问题。为了解决杨树育种周期长及转基因安全性等问题,本研究拟以美洲黑杨雄性花芽为试材,以cDNA文库构建及其质量鉴定为切入点,采用大规模随机EST测序,进而分离得到与花发育相关的基因。在此基础上,开展与花发育相关基因的正反义植物表达载体的构建及其农杆菌介导遗传转化烟草等研究,并对所获得的转基因烟草植株进行分子检测及表型观察。通过上述研究得到以下主要结果:1.首次以美洲黑杨雄性花芽为植物材料,采用SMART技术,构建了第一个美洲黑杨雄性花芽全长cDNA文库。质量检测结果表明,美洲黑杨雄性花芽cDNA文库的滴度为6.8x106pfu·mL-1,文库扩增后的滴度为7×1012pfu.mL-1。经过蓝白斑计数,文库的重组率可达95%。平均插入片段大小为1 kb左右,说明所构建的文库完全符合目的基因分离筛选和表达建库的要求,可为进一步开展与杨树花发育相关基因的克隆及林木花发育分子机理的探讨等研究方面奠定重要的基础。2.随机挑取经PCR检测过的4 200个单克隆进行5’端测序,共获得3 092条原始序列。去除插入片段小于150 bp和污染序列后,获得了3 086条高质量的EST序列,通过聚类分析获得416个簇(clusters),并对每个簇进行单独拼接,进而得到451个重叠群(contigs)和1104个单一序列(singletons)。通过对1555个单一基因(uniquesequences)与NCBI数据库的比对,结果显示,34.7%(540个单一基因)与核酸和蛋白数据库无序列同源性,由此可推测,34.7%为新基因,且可能与花发育相关。同时获得了8个MADS-box基因,其中3个是杨树中未见报道的基因,且均含有全长的CDS。3.对3个未见报道的杨树新基因的其中两个进行核酸序列比对分析,结果表明,PdPI基因序列与荔枝、桦树、黄瓜以及苹果的MADS基因序列的同源性极高(均达80%以上),但PdAGL与核酸数据库中的基因序列同源性较低。通过对蛋白序列进一步比对分析后发现,PdPI和PdAGL均含有高度保守的MADS、中度保守的K区以及非保守的I区和C区,其中PdPI基因在C区还含有极保守的PI基序(motif)。系统进化树分析结果表明,PdPI和PdAGL分别属于MADS基因家族中的PI亚家族和DEFH 7亚家族。4.运用实时定量PCR(Real time PCR)方法对PdPI和PdAGL基因在花芽发育各时期表达量测定,结果发现,PdPI基因在花序出苞片的过程中表达量急剧上升,且在根中的表达量也较高,因此可推测该基因可能与花粉成熟以及根的生长发育有关。这说明拟南芥PI同系物不仅能在生殖器官中表达,而且在营养器官中也表达。另外,PdAGL基因不仅在花器官中表达,而且也在形成层和叶中表达。虽然PdAGL基因与金鱼草DEFH 7基因的亲缘关系最近,但其表达方式不同于DEFH 7基因。5.在PdPI和PdAGL基因的正反义植物表达载体的成功构建以及高效稳定烟草转化体系建立的基础上,采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,以NPTⅡ基因为扩增目的基因,并对所获得的具有卡那抗性的转基因烟草植株进行PCR检测。结果表明,目的基因已整合到转基因烟草植株的基因组中。此外,通过转基因烟草植株的表型观察,结果发现,转正义PdPI基因烟草植株存在提前开花现象,而转反义PdAGL基因部分植株出现叶片畸形、花期晚、花量少等特点。