光肩星天牛纤维素酶特性研究及结合短肽筛选

来源 :北京林业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wanshanshan1989
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光肩星天牛Anoplphora glabripennis(Motsch.)是中国杨树最重要的蛀干害虫,广泛分布于中国24个省市自治区;取食杨、柳、榆、槭、槐、桑等多种林木,给中国的人工林造成严重威胁.由于天牛幼虫钻蛀树干隐蔽为害,世代长且不整齐,天敌种类少,因而控制难度极大,目前仍缺乏十分十分简便有效的控制措施.天牛幼虫纤维素酶抑制剂的研究和应用及抗虫基因工程育种是生物途径控制天牛的有效措施.该研究在对光肩星天牛幼虫的纤维素酶体系的组成和特性进行研究的基础上,运用噬菌体展示(phage display)技术筛选出与内切葡聚糖酶两种同工酶特异结合的短肽序列,并人工合成这两个短肽,进而对其结合特性作进一步分析.1.利用不同酶的底物特性,对光肩星天牛幼虫消化道内纤维素酶系组成及其主要纤维素酶的理化性质进行了研究,结果表明光肩星天牛幼虫肠道内具有完整的纤维素酶体系,包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶,其中内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的活性远远高于外切葡聚糖酶,为其主要的纤维素消化酶类.2.利用羧甲基纤维素聚丙烯酰胺凝胶电泳(CMC-PAGE)技术结合酶活性化学显色反应,检测到光肩星天牛幼虫内切葡聚糖酶的两种主要同工酶,分别命名为AgEG1和AgEG2.3.运用随机七肽噬菌体展示库对固定于酶标板的AgEG1进行3轮亲和筛选,噬菌体的回收率提高了67倍.随机挑取第三轮筛选的12个噬菌体克隆进行DNA序列分析,结果12个噬菌体克隆的随机序列中出现一个重复序列LPPNPTK,且其它10个克隆中LPP基序出现的频率高达60%.4.按照以上的筛选方法对AgEG2进行了3轮亲和筛选,噬菌体回收率提高了215倍.5.通过点杂交和Western杂交研究合成肽LPPNPTK和TPHRSPL对靶分子的结合特性.
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