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新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的一种以禽类呼吸道、消化道黏膜出血为特征的急性、烈性、败血性传染病。NDV感染引起机体各组织不同程度的渗出性炎症,反映了NDV致病能力的高低,然而目前对其炎症反应的机制尚不清楚。1-磷酸鞘氨醇受体1(Sphingosine-1-phosphate receptor 1,S1PR1)是病毒诱导的炎症致病中关键的免疫调节因子,关于禽类S1PR1分子的功能研究鲜见报道,鸡S1PR1在ND炎症反应的功能值得探讨。本研究分别以强、弱NDV毒株感染鸡胚成纤维细胞(DF-1)、鸡髓样树突状细胞(m DCs)和SPF鸡为模型,通过体内和体外试验综合比较不同毒力NDV感染引起的炎症反应及S1PR1的表达差异;在此基础上,研究S1PR1调控NDV引起宿主炎症反应的分子机制,为临床上控制NDV感染引起的炎症反应及应用免疫调节性药物防治ND提供理论指导。本研究主要内容如下:1.不同毒力新城疫病毒感染引起的鸡炎症反应及鸡S1PR1基因的表达本研究首先选取2株生物学特性差异较大的NDV毒株GM株和La Sota株感染SPF鸡,观察不同毒株引起的炎症表现,并通过荧光定量PCR对促炎性细胞因子IL-1β的转录进行分析。强毒株GM株感染后表现出渗出性炎症症状,感染鸡呼吸道出现大量黏液,消化道有明显的出血点;而La Sota株仅表现出轻微的呼吸道症状。组织切片观察可见,在GM株感染鸡的脑、肺脏、脾脏和腺胃中出现出血和大量炎性细胞浸润等炎性显微病理变化,La Sota株仅有少量炎性细胞聚集。GM株在小肠、脑、法氏囊、腺胃和盲肠扁桃体中增殖显著上调,依次为27.5倍、14倍、5.6倍、3.8倍和3.5倍;La Sota株仅在脑中增殖水平较高(6.8倍)。在感染组脏器中检测到IL-1β的上调表达,GM组高达8.7倍,La Sota组达到6.4倍,GM组的表达水平达显著高于La Sota组。NDV感染后S1PR1在脑、肝脏、腺胃和法氏囊中表达量较高,最高可达6倍(脑),最低为2倍(法氏囊);在肾脏、小肠和胰腺等组织中表达下调。为研究鸡S1PR1的功能,本研究从DF-1细胞中扩增了鸡S1PR1基因,并构建了真核表达载体p CI-S1PR1,在DF-1细胞中鸡S1PR1基因得到了有效的表达。2.S1PR1参与调控NDV诱导的炎症反应为探究S1PR1与NDV炎症的关系,本研究检测了NDV感染后DF-1细胞中炎性细胞因子及S1PR1的表达:GM感染后IL-1β、IL-6和IL-18表达显著上调,依次达22倍、41倍和5.5倍,La Sota株感染组与对照组无显著差异,仅有2倍、1.2倍和1.5倍上调;GM感染诱导IL-8和CCL5 48倍和9.2倍的上调表达,La Sota株感染组也有8.5倍和4.3倍上调表达,显著高于对照组;TNF-α在La Sota组后呈2.8倍的上调表达,而GM组表达下调。GM株感染引起S1PR1基因2.5倍的上调表达,而La Sota株感染后S1PR1的表达水平无显著差异;NDV感染3 h起,可在感染细胞中检测到S1PR1的蛋白表达,且GM组表达水平高于La Sota组。使用W146抑制S1PR1基因表达后,显著下调IL-6(40倍)和IL-1β(10倍)的转录和160 pg/m L、250 pg/m L蛋白表达。S1PR1过表达显著上调NDV诱导的IL-1β的基因转录(5倍)和蛋白表达水平(250 pg/m L),下调IL-6的表达210 pg/m L。抑制或过表达S1PR1基因不影响NDV的复制与增殖。3.S1PR1调控新城疫病毒感染引起炎性反应的信号通路研究为进一步研究S1PR1对NDV炎症反应的调控机制,选择与诱导IL-1β表达相关的核转录因子NF-κB开展研究。本研究利用NDV强毒GM株感染DF-1细胞,在GM株感染早期Rel A/p65的表达水平显著上调,在感染3 h其m RNA水平达到6.7倍,至感染6 h达到最高峰(10.8倍),后呈下降趋势,感染24 h其表达水平与未感染组无显著差异;NDV感染后细胞荧光素酶值显著上调,高于对照组12倍;在感染3 h其蛋白表达水平最高,随着感染时间的延长逐渐降低。W146处理后,NDV感染引起的NF-κB转录显著下调,比DMSO处理组降低了10倍;其荧光素酶值显著下调了1.5倍。此外,W146处理组NF-κB的蛋白表达水平和亚细胞定位情况与DMSO处理组无显著差异。由于NF-κB的激活还需要IκB蛋白的磷酸化等过程,因此,本研究对于S1PR1能否调控NF-κB信号通路还不能提供明确的结论,具体通路有待研究。4.不同毒力NDV诱导的鸡DC细胞炎症反应为了更加全面地研究NDV感染引起的鸡炎症反应,本研究选择具有抗原递呈功能的树突状细胞(DC)作为模型,研究NDV在其中的炎性反应。首先从雏鸡骨髓中分离单核细胞,利用GM-CSF和IL-4在体外诱导分化成DC。根据细胞分化周期和病毒感染特性,在细胞培养第3天分别接种NDV毒株GM株和La Sota株,检测NDV复制以及炎性细胞因和S1PR1的表达。结果显示,NDV在DC中能够有效复制并形成细胞病变,GM株最高滴度可达107.2 TCID50/100μL,与La Sota株最高峰值差约为10 000倍。GM组感染后IL-1β(10.2倍)、IFN-β(7.6倍)和CCL5(35.4倍)的表达显著上调;而La Sota株诱导IL-10表达(峰值为7.5倍),上调CCL5表达(14.3倍)。S1PR1基因在DC细胞中呈下调表达。本研究从NDV感染过程中机体免疫和病毒感染的动态变化出发,结合对免疫调节分子S1PR1的研究,对NDV感染导致机体渗出性炎症的分子机制进行研究。主要发现了S1PR1分子在NDV感染禽类的炎症反应中具有调节细胞因子表达水平的作用,丰富了NDV致病机制的内容,为临床上控制NDV感染引起渗出性炎症及应用免疫调节性药物防治ND提供科学的理论指导。