放射性肺损伤（radioactive lung injury）是胸部肿瘤放疗、骨髓移植辐射预处理及核泄露事故常见的并发症。随着肿瘤发病率的逐年增加，接受放射治疗的患者也大幅增加，尽管近年来放射治疗技术水平和设备的大幅进步，减轻了肿瘤周围正常组织的损伤，但放射性肺损伤的发生率仍然居高不下。目前临床上缺乏有效的防治放射性肺损伤措施，使其成为影响肿瘤患者放疗的主要剂量限制性因素，因此，放射性肺损伤的防治是放射医学和临床肿瘤学急待解决的问题。近年来大量研究表明，氧化应激在放射性肺损伤及纤维化形成中发挥着重要作用。国内外多家科研机构发现长时间的氧化应激和正常组织的持续性缺氧与放射性肺损伤的发展密切相关，可能是导致肺持续性损伤的原因。当射线作用于肺组织时，由于其对水分子和靶分子的离子化作用，可导致活性氧类物质迅速爆发性生成。瞬间大量生成的ROS一方面直接造成肺组织实质细胞的损伤，另一方面激活炎症细胞间接加重组织损伤。照射引起的氧自由基生成增加可引起应激敏感的激酶和转录因子的迅速激活，炎症性细胞因子生成增加。照射引起肺损伤后，肺泡巨噬细胞被激活，在发挥清除坏死组织作用过程中可产生大量的ROS，此外它还通过趋化作用导致更多的免疫效应细胞（淋巴细胞，中性粒细胞等）浸润受损的肺组织，而这些细胞在发挥生物效应的同时也会产生大量ROS。机体的内源性ROS主要在细胞线粒体中生成，在线粒体的电子传递链中存在电子渗漏，其部分还原O2而产生，此外部分ROS还来自于细胞内生性的黄素酶（如：黄嘌呤氧化酶），脂肪氧化酶，环氧合酶以及浆膜相关的氧化酶（如：吞噬细胞NAPDH氧化酶）等催化产物。这些大量生成的ROS能很快将机体的抗氧化能力消耗殆尽，加重肺实质细胞损伤，导致肺部炎症持续存在。NrF2-ARE信号通路是迄今发现的最重要的抗氧化应激相关的信号传导通路。NrF2-ARE信号通路在抗肿瘤、抗炎、抗凋亡等可发挥重要的细胞保护作用，逐渐引起人们的重视。当细胞遭到ROS或亲电子物质攻击时，一方面对Keap1分子的半胱氨酸残基进行化学修饰，引起Keap1构象改变，导致NrF2-Keap1复合体解离，NrF2入核，另一方面通过激活促分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和蛋白激酶C（PKC）和磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）使NrF2分子磷酸化而激活。活化的NrF2分子与Maf蛋白结合成异二聚体后识别ARE元件启动Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的转录，提高细胞抗氧化应激的能力。受NrF2-ARE信号通路调控的抗氧化酶主要有血红素加氧酶（HO-1）、 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、NAD(P)H:醌氧化还原酶-1（NQO-1）、超氧化物歧化酶等。NrF2在肺组织细胞内呈高表达可能与其暴露于外环境容易接触活性氧及毒素有关。放射线作用于肺组织时，有大量ROS生成，上调NrF2水平对调控肺内氧化/抗氧化平衡起重要作用。大量研究表明，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)具有抗氧化、抗脂质过氧化、清除自由基、抗突变和抗肿瘤形成等生物学活性和药理效应。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）结构中含有多个酚羟基,可作为供氢体而提供H+,许多体内外实验证实EGCG是强供氢体抗氧化剂和自由基清除剂。EGCG尚可通过与金属螯合以减少离子对氧化反应的催化以及增强抗氧化物酶活性而发挥抗氧化作用。EGCG可通过介导STAT信号通路，调节转录因子T-bet和维生素A相关孤儿受体γ/α(RORγ/α)选择性抑制CD4+T细胞生成IFN-γ和IL-17，直接抑制Th1和Th17细胞分化，还可通过改变CD80和CD86表达而抑制抗原提呈细胞（APC）的协同刺激功能，证实了EGCG可通过抑制免疫细胞合成释放炎症因子和调节免疫功能发挥抗炎作用。EGCG可通过诱导激活Nrf2-Keap1信号途径提高内源性抗氧化应激能力。共聚焦显微镜，免疫印迹及RT-PCR研究证实，EGCG可明显诱导NrF2表达增加并促进NrF2-Kaep1复合体解离，促进NrF2分子入核上调抗氧化酶和解毒酶表达。此外，EGCG尚能通过抑制NF-κB表达而发挥抗炎活性。EGCG的抗氧化应激作用可能对放射性肺损伤有治疗或控制肺纤维化发展的作用，目前此方面研究匮乏，因此，我们利用Co60源建立大鼠放射性肺损伤模型，以EGCG进行干预，探讨其对放射性肺损伤的保护作用及相关机制，以期为放射性肺损伤防治提供新的途径和参考。第一部分大鼠放射性肺损伤模型的建立与鉴定目的：采用Co60γ射线照射大鼠全肺建立大鼠放射性肺损伤模型，进行持续病理学观察，考察氧化应激在此中的作用，为下一步防治放射性肺损伤研究提供大鼠模型和理论依据。方法：采用Co60源22Gy单次照射SD大鼠全肺。分别于照射前、照后1天，7天，15天，21天，30天，60天，120天活杀大鼠，计算肺系数，右肺行HE染色、Masson染色及天狼猩红染色，观察肺组织病理变化并对大鼠肺泡炎及纤维化程度进行评分，免疫组化法检测肺组织α-SMA、SPB表达情况；左肺进行羟脯氨酸含量测定；血清测定MDA含量、总SOD活力和TGF-β1含量。结果：（1）大鼠肺脏于照后15天开始出现明显大体改变，受照部位出现脱毛和皮肤溃疡，肺脏肿胀，表面可见出血点，并随时间延长逐渐加重，至照后30天最为严重。照后60天至120天，肺脏塌陷，表面可见结节状及条索状灰白色纤维化病灶。肺系数自照后15天（5.864±0.148）起显著增加，与正常对照组（5.098±0.445）比较，P＜0.05，随时间延长肺系数逐渐增加，照后60天至120天略有降低但仍明显高于正常对照组（P＜0.05）。（2）照后7天至30天肺组织以间质性渗出性炎症为主要病变，并随时间延长逐渐加重，肺泡炎评分在照后7天（8.833±1.329）开始明显增加（与正常对照组比较，P＜0.001），至照后30天肺泡炎评分（22.333±2.066）达最高，照后60天（21.167±2.317）和120天（21.333±3.266）肺泡炎评分略有降低，但与照后30天比较无明显统计学差异（P＞0.05）。（3）照后60天至120天以肺组织细胞增生性炎症和纤维化病灶形成为主要病变，肺纤维化评分在照后15天（8.833±2.137）开始明显增加（与正常对照组比较，P=0.001），照后21天与15天无明显差异（P＞0.05），照后30天至120天肺纤维化评分进行性增加（组间比较，P＜0.05）。（4）肺组织HYP含量自照后15天（0.442±0.056）起明显增高，与正常对照组（0.168±0.021）比较，P＜0.05，且其含量随时间延长逐渐增加。（5）血清T-SOD活力照后1天（104.168±8.975）至7天（109.075±12.719）短暂增加，与正常对照组（79.613±10.210）比较，照后1天P=0.003，照后7天P＜0.001，照后15天T-SOD活力又明显降低，至照后120天T-SOD活力一直维持在较低水平，与正常对照组比较，P＞0.05。（6）血清MDA含量于照后1天（4.055±0.617）即出现明显增高，与正常对照组（2.491±0.653）比较，P=0.007，其含量随时间延长逐渐增高，与正常对照组比较，P＜0.001。（7）大鼠血清TGF-β1含量自照后15天（2816.52±191.142）开始明显增加，与正常对照组（2150.31±127.768）比较， P＜0.001，且随时间延长其含量逐渐增高。（8）肺组织α-SMA表达自照后15天（0.085±0.014）开始增加，但较正常对照组（0.048±0.013）比较，P＞0.05，照后60天至照后120天其表达显著，与正常对照组比较，P＜0.05。（9）肺组织SPB表达于照后7天（0.313±0.074）明显降低，与正常对照组（0.479±0.078）比较，P＜0.05，随时间延长其表达水平进一步降低，照后60天至120天SPB表达略有增加，但仍显著低于正常对照组，P＜0.05。结论：（1）照后7天肺组织开始出现较明显的炎症改变，小血管扩张，肺泡间隔增宽，可见炎性渗出和炎症细胞浸润，随时间延长肺组织炎症逐渐加重，至照后30天肺组织炎症最为严重。（2）照后15天肺组织开始出现胶原沉积，随时间逐渐加重，照后60天和120天肺部炎症略减轻，出现以肺纤维化为主要特征的病理改变，纤维化病灶内以Ⅰ型胶原纤维沉积为主。（3）照后15天反映放射性肺损伤的血清学指标TGF-β1水平开始明显升高，随时间延长升高更加明显，提示照后大鼠的肺损伤逐渐加重。（4）反映氧化应激损伤水平的血清MDA含量自照后15天开始明显增加，随时间延长持续增加，与肺损伤程度相一致；血清T-SOD活力仅在照后早期增加，后期活力降低明显，甚至低于正常对照，反映出后期机体内源性抗氧化应激系统的失代偿，氧化应激加重肺组织的损伤。（5）肺组织α-SMA表达于照后60天至120天表达水平显著增加，表明肌成纤维细胞在放射性肺损伤后期纤维化发生中发挥重要作用。（6）照后7天肺泡Ⅱ型细胞数量显著减少，随时间延长进一步减少，可能与氧化应激引起的细胞损伤有关；照后60天，尤其是120天可见增生的异常形态肺泡Ⅱ型细胞，提示其可能参与了晚期放射性肺损伤的纤维化发展。第二部分EGCG对大鼠放射性肺损伤防治作用及机制探索目的：利用Co60源建立大鼠放射性肺损伤模型，以EGCG和地塞米松进行干预，探讨EGCG对放射性肺损伤的保护作用及相关机制。方法：利用Co60源γ射线22Gy单次照射大鼠全肺构建放射性肺损伤模型，照后2小时内分别给予地塞米松注射液和EGCG干预治疗。以肺系数、HE染色、Masson染色和肺组织羟脯氨酸（HYP）含量观察及评价EGCG对放射性肺炎及纤维化的改善情况；检测大鼠血清TGF-β1含量；检测血清总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力和丙二醛（MDA）含量，评价EGCG对模型大鼠氧化应激的改善情况；免疫组化法检测肺组织α-SMA、SPB表达情况，观察EGCG对肌成纤维细胞转化和肺泡Ⅱ型细胞的影响；利用流式微球分析技术（Cytometric bead array，CBA）检测大鼠血清IL-6，IL-10， IFN-γ，TNF-α含量；蛋白免疫印迹法（WB）检测肺组织Nrf-2、HO-1、NQO-1表达，观察EGCG对NrF2-ARE信号通路的影响，探讨EGCG的抗氧化应激机制。结果：（1）经EGCG治疗后，大鼠受照部位脱毛及皮肤溃疡明显改善，肺部充血水肿等大体改变明显好于模型组和地塞米松组，肺系数于照后15天至60天较模型组有明显降低（P＜0.05），且照后30天至120天明显低于地塞米松组（P＜0.05）。（2）EGCG组照后15天和30天肺组织炎症渗出及炎症细胞浸润明显改善，肺泡炎评分与模型组比较，P＜0.05；照后15天与地塞米松组比较无统计学意义，P＞0.05，照后60天和120天肺部炎症较模型组与激素组均有明显减轻（肺泡炎评分，P＜0.05）。（3）EGCG组照后30天至120天肺实质内胶原纤维沉积及纤维化程度明显好于模型组和地塞米松组，肺纤维化评分比较有显著统计学差异（P＜0.05）。（4）EGCG组15天至120天肺组织HYP含量显著降低，与模型组比较有显著统计学差异（P＜0.05），照后60天和120天显著低于地塞米松组（P＜0.05）。（5）与模型组比较，EGCG组照后15天至120天血清TGF-β1含量显著降低（P＜0.05），照后30天至120天与地塞米松组比较有显著降低（P＜0.05）。（6）与模型组比较，EGCG组照后15天至120天血清MDA含量明显降低（P＜0.05），照后60天和120天明显低于地塞米松组（P＜0.05）。（7）EGCG组照后15天至120天血清总SOD活力水平与正常对照组、模型组和地塞米松组比较，明显增高（P＜0.05）。（8）EGCG组照后15天血清IL-6与TNF-α水平升高不明显，与正常对照组比较无显著统计学差异（P＞0.05），与模型组比较有明显统计学差异（P＜0.05），IL-10和IFN-γ含量升高明显，与正常对照组比较有显著统计学差异（P＜0.05），但与模型组和地塞米松组比较无显著统计学差异（P＞0.05）；照后30天至120天，大鼠血清各炎症因子水平有所升高，但明显低于模型组和地塞米松组（P＜0.05）。（9）EGCG组照后15天和30天肺实质内少见α-SMA表达，OD值与正常对照组比较无明显统计学差异（P＞0.05），照后60天至120天肺组织内可见散在α-SMA表达增加，OD值与正常对照组比较有明显统计学差异（P＜0.05），OD值与模型组比较P＜0.01，与地塞米松组比较P＜0.05。（10）EGCG组照后15天及30天肺组织SPB表达减少，OD值与正常对照组比较有显著差异（P＜0.05），但较模型组和地塞米松组有明显增加，OD值与模型组和地塞米松组比较有显著差异（P＜0.05），照后60天至照后120天SPB表达仍明显高于模型组和地塞米松组（OD值，P＜0.05），肺泡Ⅱ型细胞的异常增生不明显，且肺泡壁仍可见较多的正常肺泡Ⅱ型细胞分布。（11）EGCG组照后15天肺组织Nrf-2、HO-1、NQO-1表达即明显增高，与正常对照组、模型组和地塞米松组比较均有显著统计学差异（相对光密度值P＞0.05）；照后30天至120天肺组织Nrf-2、HO-1、NQO-1表达持续增高并维持在较高水平上，与模型组和地塞米松组比较均有显著的统计学差异（相对光密度值，P＜0.05）。结论：（1）EGCG能够减轻放射性肺损伤早期炎症反应，延缓晚期肺纤维化发展；（2）EGCG在抗炎和抗纤维化效果的延续性上优于地塞米松；（3）EGCG能够降低受照大鼠血清MDA水平，提高SOD活力，改善大鼠机体氧化应激状态，减轻ROS对肺组织的持续损伤，充分体现了其抗氧化能力，此性质可能是EGCG发挥保护作用的主要机制；（4）EGCG能够保护肺泡Ⅱ型细胞并抑制其异常转化增生，可能与EGCG的抗氧化应激性能相关；EGCG能够阻滞肺组织肌成纤维细胞转化和增殖，并以此减轻肺纤维化病变；（5） EGCG能够降低肺损伤大鼠血清炎症细胞因子IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平，佐证了其在治疗放射性肺损伤过程中有较强的抗炎症反应能力。（6）EGCG可通过激活NrF2-ARE信号途径，增加Ⅱ相抗氧化酶和解毒酶的表达和活性，提高受照机体抗氧化能力，在维持氧化/抗氧化平衡体系发挥了较大作用。总之，EGCG可以通过清除机体氧自由基，减少氧自由基过度生成，激活内源性抗氧化应激机制，免疫调节等多种分子机制保护肺实质细胞损伤，改善肺组织炎症反应和纤维化病变，为放射性肺损伤防治提供了新的线索。