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葡萄糖二酸(Glucaric acid,Saccharic acid,GA)是一种具有重要生物功能的有机酸,在医药、化工、食品等领域有着广泛的应用。目前葡萄糖二酸的制备主要依赖于投入高、得率低,同时对环境造成一定污染的化学氧化法,这限制了葡萄糖二酸的广泛应用。微生物发酵制备葡萄糖二酸为研究者们提供了新的思路。本研究对毕赤酵母(Pichia pastoris)内源的肌醇加氧酶进行了功能验证,并在P.pastoris内成功构建了葡萄糖二酸合成途径,通过优化途经酶的表达,对高产菌株摇瓶发酵优化及分批补料培养,葡萄糖二酸的产量进一步得到了提高。具体研究结果如下:(1)P.pastoris内源肌醇加氧酶(ppMIOX)的功能验证。通过将P.pastoris中内源ppMIOX的氨基酸序列与其他不同来源的MIOX序列进行多序列比对分析,发现该序列与其他MIOX序列同源性较高,并且含有MIOX保守的催化活性位点及底物结合位点。将ppMIOX基因在P.pastoris内过量表达,证明了ppMIOX能够将肌醇转化生成葡萄糖醛酸,具有MIOX的催化功能。综合上述两点,本研究确定该蛋白为肌醇加氧酶;(2)P.pastoris内葡萄糖二酸合成途径的构建。通过表达MIOX基因(ppMIOX或mMIOX)以及udh基因,在P.pastoris内构建了葡萄糖二酸合成途径。发酵60 h后,在只添加葡萄糖的培养基中,只有P.pastoris GS115-U-mM能检测到葡萄糖二酸,产量为107.19±11.91 mg·L-1;而添加前体肌醇后,P.pastoris GS115-U-pM及P.pastoris GS115-U-mM均能检测到葡萄糖二酸,产量分别为90.46±0.04 mg·L-1及785.4±1.41mg·L-1;而P.pastoris GS115-U及对照菌P.pastoris GS115则不能检测到产物。通过对途径酶进行分析,mMIOX催化活性优于ppMIOX,并且mMIOX酶活受肌醇的影响;Udh能够稳定表达并且活性较高;(3)融合表达途径酶,进一步提高葡萄糖二酸产量。本研究将途经酶Udh融合在mMIOX的N端,并在两个酶之间添加不同性质的连接肽。融合菌P.pastoris GS115-U-(G4S)1-mM、P.pastoris GS115-U-(EA3K)3-mM及P.pastoris GS115-(U-mM)的产量得到了一定程度的提高,分别为944.67±5.31 mg·L-1、930.63±3.35 mg·L-1及921.30±45.86 mg·L-1,表明连接肽(GGGGS)1及(EAAAK)3的应用有利于葡萄糖二酸产物的合成。并且,通过添加连接肽(GGGGS)1及(EAAAK)3后,mMIOX的酶活性相比未融合之前(3.21±0.17 U·mg-1)得到了提高,分别为5.46±0.32 U·mg-1及5.16±0.17 U·mg-1;(4)重组高产菌P.pastoris GS115-U-(G4S)1-mM的摇瓶发酵优化及分批补料培养。对P.pastoris GS115-U-(G4S)1-mM进行摇瓶发酵优化,确定最优初始葡萄糖浓度为60g·L-1,最适初始pH为5.5,最适接种龄为24 h,最优接种量为25%,最优初始肌醇浓度为10 g·L-1。相比优化前,葡萄糖二酸的产量达到了1697.60±74.61 mg·L-1,提高了70.85%;按照上述结果,将P.pastoris GS115-U-(G4S)1-mM在3-L发酵罐中进行分批补料培养。发酵96 h后,在流加葡萄糖及前体肌醇的情况下,葡萄糖二酸的产量达到了6.61±0.30 g·L-1。