蛋白质翻译后修饰是蛋白质发挥功能的重要调节机制,包括磷酸化、乙酰化、糖基化、泛素化以及类泛素化等。Neddylation修饰是一种类似于泛素化修饰的蛋白质翻译后修饰机制,参与细胞增殖与发育、DNA损伤修复、蛋白质稳定性、转录调控、染色体形成、细胞凋亡与自噬等重要的生物学过程,并与一些病毒的复制有关。家蚕是生产上的一种重要的经济昆虫,也是科学研究领域的一种重要的模式生物。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus,Bm NPV)对于家蚕来说是一种重要的致病病原,每年都给蚕业生产造成了重大损失。本课题从克隆Neddylation修饰途径关键基因NEDD8开始,研究了家蚕NEDD8基因的特征,并探讨了Neddylation修饰与家蚕核型多角体病毒复制的关系,主要结果如下:(1)根据NCBI数据库登录的基因信息从家蚕细胞中成功克隆出NEDD8基因,ORF大小为234bp,共编码77个氨基酸,蛋白质分子质量约为8.47k Da,无信号肽。NEDD8氨基酸序列与其他模式生物及家蚕泛素相关蛋白质具有高度保守性,且家蚕NEDD8与家蚕的泛素序列一致性最高。荧光定量PCR检测显示NEDD8在家蚕五龄幼虫不同组织中均有表达,其中头部中表达量最高,其次是丝腺中,而在精巢和卵巢中表达量最低。NEDD8在家蚕5龄第3天幼虫始到化蛹后第3天m RNA表达量逐渐增加,在化蛹后第9天时达到最高,化蛾时降低。通过构建GFP融合表达的重组Bm NPV感染家蚕Bm N细胞,在共聚焦显微镜下定位显示NEDD8在Bm N细胞内普遍存在,分布于整个细胞中,并且在感染48 h后存在细胞质内的聚集现象。(2)利用Neddylation修饰特异性抑制剂MLN4924研究了Neddylation修饰对Bm NPV的作用,结果显示MLN4924对BV粒子产生的影响和多角体形成的影响有显著的抑制效果,并且病毒DNA复制和病毒蛋白的表达都受到了抑制,但对BV病毒粒子对细胞的吸附、侵入没有显著影响。(3)运用免疫共沉淀和LC-ESI-MS/MS质谱分析方法来筛选家蚕细胞中NEDD8修饰的相关蛋白。从家蚕Bm N细胞中总共筛选出28个NEDD8修饰的可能底物蛋白,28个家蚕蛋白中有17个能够被匹配到GO中,其中分子功能条目下,42.86%和46.43%的蛋白分别参与结合和催化活性;细胞组成条目下,26.83%,26.83%和19.5%的蛋白分别被归类为细胞、细胞部分和细胞器;参与的生物过程条目下,30%,24%和8%蛋白分别参与代谢、细胞内加工和单有机体加工等等。KEGG通路分析显示NEDD8修饰的相关蛋白参与了Ubiquitin mediated proteolysis、Proteasome、m RNA surveillance pathway等33个通路。表明家蚕细胞中NEDD8可能参与了细胞凋亡、蛋白降解、转录调控等过程。