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MicroRNA（miRNA）是近年来在生物体内发现的一类长度在19～22核苷酸、内源性单链小分子RNA,它通过与靶基因mRNA 3’非翻译区（3’-UTR）相应靶序列碱基之间不完全或完全的互补结合,抑制mRNA的翻译或引起mRNA的降解,发挥对靶基因的沉默效应。miRNAs调节细胞增殖、凋亡、分化以及迁移等重要的生物学过程。越来越多的证据表明,一些miRNAs在肿瘤组织中表达异常,参与了肿瘤的发生和发展。miR-199a是高度保守的miRNA,在多种肿瘤中表达异常,与肿瘤的发生密切相关。本文用实时定量RT-PCR方法分析配对的肝癌组织和癌旁组织中成熟miR-199a的表达,发现miR-199a在肝癌组织中表达下调,和其它学者miRNA表达谱的结果一致。由此我们设想肝癌的发生可能和miR-199a的表达下调有关,miR-199a可能通过调控靶基因的表达参与肝癌的发生发展,恢复miR-199a的表达可能会抑制肝癌的生长。研究方法1.应用Stem-loop实时定量RT-PCR方法分析11对配对的肝癌组织和癌旁组织中成熟miR-199a的表达。2. miR-199a靶基因的预测和验证应用生物信息学预测miR-199a可能作用的靶基因。利用Ambion公司合成Pre-miRTM miRNA Precursor miR-199a及negative control,瞬时转染入肝癌细胞;Western blot检测潜在靶基因蛋白表达情况;Real-time PCR检测潜在靶基因mRNA表达情况;构建包含HIF-1α-3’-UTR野生型的报告基因载体或HIF-1α-3’-UTR突变型的报告基因载体,与miR-199a Precursor或pre-scramble共转染,检测报告基因活性。3. miR-199a高表达病毒感染肿瘤细胞及其稳定株的筛选鉴定扩增miR-199a的慢病毒表达载体及其阴性对照载体,分别与慢病毒包装系统共同转染293FT细胞包装病毒,48h后收集慢病毒上清,过滤后加入辅助感染试剂polybreen感染肿瘤细胞。western blot检测潜在靶基因及相关蛋白表达; Real-time PCR检测HIF-1αmRNA的表达;RT-PCR检测VEGF mRNA表达水平;荧光素酶报告基因实验鉴定稳定细胞株。4. miR-199a对肝癌的抑制作用对瞬时转染miR-199a和稳定表达miR-199a的肝癌细胞,检测细胞生长曲线;MTT法检测miR-199a对细胞增殖的影响;克隆形成实验检测单个肿瘤细胞集落生长能力;流式细胞术检测细胞周期变化;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力;收集稳定表达miR-199a的肝癌细胞和对照组肝癌细胞,皮下接种BALB/c裸鼠,成瘤后每隔5d测量肿瘤体积,实验结束测量肿瘤重量,观察肿瘤细胞成瘤性。研究结果1.成熟miR-199a在肝癌组织中表达下调。2. miR-199a靶基因预测和验证。生物学软件预测,HIF-1α可能是miR-199a作用的靶基因。HIF-1α-3’-UTR与miR-199a结合位点5’端7个核苷酸序列的自由能为-15.2kcal/mol,低于随机平均自由能阈值（△G=-14.01kcal/mol）Western blot检测发现miR-199a在常氧和缺氧条件下均可抑制HIF-1α蛋白的表达;Real-time PCR结果显示转染miR-199a precursor后, HIF-1αmRNA的表达量和对照组相比无显著差异;报告基因实验结果表明,瞬时转染的miR-199a能够抑制转染的HIF-1α-3’-UTR报告基因活性,而共转染miR-199aprecusor和HIF-1α-3’-UTR靶位点突变载体,荧光素酶活性未见明显改变。3.miR-199a高表达病毒感染肿瘤细胞及其稳定株的建立扩增慢病毒穿梭载体及其对照载体,分别与慢病毒包装系统共同转染293FT细胞包装病毒,48h后收集慢病毒上清,过滤后加入辅助感染试剂polybreen感染肿瘤细胞,经嘌呤霉素筛选3周后获得表达miR-199a的稳定细胞株;western blot结果显示miR-199a稳定表达株中HIF-1α、P-AKT表达下调;Real-time PCR检测发现miR-199a稳定表达株中HIF-1αmRNA表达量和对照组相比无显著差异;RT-PCR结果显示稳定表达miR-199a的肝癌细胞株中VEGF mRNA表达水平下调。报告基因实验结果表明,稳定细胞株表达的miR-199a能够抑制转染的HIF-1α-3’-UTR报告基因活性,而对HIF-1α-3’-UTR靶位点突变的报告基因活性未见明显影响。4.miR-199a对肝癌的抑制作用生长曲线结果表明过表达miR-199a的肝癌细胞生长明显减慢; MTT结果提示miR-199a能够抑制肝癌细胞增殖;克隆形成实验发现miR-199a的肿瘤细胞集落生长能力降低;流式细胞术检测发现对照组的HepG2细胞在G1/G0期细胞的比例分别为48.53%,而实验组HepG2细胞在G1/G0比例则增至59.17%,实验组在S期细胞的比例为25.91%,低于对照组在S期细胞的比例为31.25%,实验结果提示miR-199a引起细胞周期G1阻滞;Transwell侵袭实验发现miR-199a能够抑制肝癌细胞侵袭能力。应用稳定表达miR-199a的肝癌细胞,建立动物模型,结果发现,和对照组相比,实验组肿瘤生长缓慢;皮下接种BALB/c裸鼠40d后,实验组体积大小分别为空载对照组、空白对照组的47%和45%研究结论1. miR-199a在肝癌组织和肝癌细胞系表达显著降低。2.生物学信息预测HIF-1α是miR-199a的靶基因。Western blot和荧光素酶报告基因实验证明HIF-1α是miR-199a的靶基因。3.miR-199a抑制肝癌细胞的增殖和侵袭能力,引起细胞周期G1阻滞。4. miR-199a可以在体内抑制肿瘤的生长。5. miR-199a在肝癌中表达下调,恢复miR-199a在肝癌中的表达能够在体内外引起肝癌细胞的生长,可能与其负调控HIF-1α的表达相关。