论文部分内容阅读
酿酒酵母是异源基因表达的重要工业宿主菌株,具有表达系统完整,培养简单,基因操作方便等优点。β-雌二醇诱导型启动子系统对于酿酒酵母完全是外源调控元件,非目标转录效应少,可以方便地控制基因的表达,为酿酒酵母相关研究提供极大的实验灵活性。神经酸是大脑神经组织和神经细胞的核心组成部分,对治疗精神病、过氧化物酶体疾病、糖尿病、艾滋病等病症有效。然而,有限的来源限制了神经酸的大规模生产和应用。因此,有必要探索利用生物转化与转基因生物合成方法,提高酿酒酵母合成神经酸的能力,以满足市场需求。本文研究以营养缺陷型酿酒酵母YS58作为出发菌株,设计并合成不受葡萄糖抑制的普适分子生物学工具β-雌二醇诱导型启动子作为代谢调控的元件,并应用于神经酸合成基因的调控探究。1、成功构建了 β-雌二醇诱导型启动子系统。在酿酒酵母YS58中以pRS416和YEplac112为出发质粒,成功构建β-雌二醇诱导型启动子重组质粒载体系统(pRS416-PReGall-GFP-TCYC、YEplac 1 1 2-PTEF1-Aritificial transativator-T cyc)。2、优化了 β-雌二醇诱导型启动子的诱导条件。检测条件为:在酶标仪中475 nm激发光和509 nm的发射光检测GFP的表达量,诱导浓度为0-0.1μM,热诱导条件为每隔8小时在37℃下进行15分钟热诱导。在此条件下,β-雌二醇诱导型启动子在酿酒酵母中可以获得更优秀的调控能力。3、探究了利用β-雌二醇诱导型启动子在酿酒酵母YS58体系中生产神经酸。利用β-雌二醇诱导型启动子构建重组质粒pRS416-PReGall-KCS-TCYC、pRS416-PReGall-FAE1-TCYC和pRS416-PReGall-ELOVL1-TCYC,在酿酒酵母中构建并加强神经酸合成途径。结果显示,表达ELOVL1基因表达的菌株,神经酸含量能达到0.57%;其次是KCS基因表达的菌株神经酸含量为0.48%;而FAE1基因表达的菌株神经酸含量最高能达到0.39%。4、探究了敲除Elo2基因对酿酒酵母神经酸合成的影响。首先构建了Elo2△-β-Estradiol酿酒酵母菌株,以此为基础构建了Elo2△-β-Estradiol-ELOVLl、Elo2△-β-Estradiol-KCS 和 Elo2△-β-Estradiol-FAEl三种酿酒酵母菌株。对以上三种菌株进行发酵培养,Elo2△-β-Estradiol-ELOVL1菌株神经酸含量最高,达到0.68%;其次是Elo2△-β-Estradiol-KCS菌株神经酸含量达到0.60%;而Elo2△-β-Estradiol-FAE1神经酸含量为0.51%。与未敲除Elo2基因的菌株相比,敲除Elo2基因的三种酿酒酵母菌株神经酸含量分别提升了 19.3%,25.0%和30.7%。