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类黄酮是植物体内广泛存在的一类次生代谢物质,在植物生长发育、逆境胁迫抗性和人类健康方面发挥重要功能。前期研究发现,烟草查尔酮合成酶基因NtCHS1在烟草类黄酮的生物合成代谢中行使重要功能。对NtCHS1基因进行功能分析和分子调控研究,对解析类黄酮的生物合成调控具有重要意义。为进一步明确NtCHS1基因在烟草类黄酮合成的调控机理,本研究以查尔酮合成酶NtCHS1的表达调控为切入点,深入挖掘和鉴定了NtCHS1基因调控因子的生物学功能和分子调控机制,具体进行了以下内容的研究:(1)本研究利用酵母单杂交文库筛选技术,系统解析NtCHS1基因在转录水平上的调控因子。将NtCHS1基因起始密码子上游1500bp的启动子序列连接到pHIS载体上,构建成诱饵载体,筛选烟草转录因子cDNA文库,共筛选到300多个转录因子,包括AP2、MYB、bHLH、WRKY等26种类型。(2)经初步分析,发现转录因子NtMYB4能够与NtCHS1基因的启动子直接结合。NtMYB4与拟南芥AtMYB4以及其他物种R2R3-MYB第四亚组成员具有较高的序列同源性,其氨基酸序列含有第四亚组R2R3-MYB类转录因子所共有的抑制基序EAR结构域pdLNLD/ElxiG/S和锌指ZINCF结构域CX1-2CX7-12CX2C。经瞬时转录激活抑制实验和亚细胞定位实验,证实NtMYB4是定位于细胞核的转录抑制因子。(3)进一步研究发现,NtMYB4的表达水平受200 mMNaCl处理后显著下调,NtMYB4过量表达转基因烟草材料表现出对盐胁迫敏感的表型,说明NtMYB4在盐胁迫抗性中可能发挥着重要的功能。对其分子调控机理研究发现,在正常情况下,NtMYB4能够抑制NtCHS1基因的表达活性。NtMYB4过量表达转基因烟草中芸香苷的含量显著下降。盐胁迫下,芸香苷含量下降的转基因烟草体内的活性氧水平,包括H2O2和O2-含量显著增加。外源添加芸香苷,能够显著降低野生型和转基因烟草体内的H2O2和O2-含量,在一定程度上增加NtMYB4过量表达转基因烟草的盐胁迫耐受性。结果表明,芸香苷含量显著降低并引起植物体内活性氧水平提高是引起NtMYB4过量表达转基因烟草盐胁迫耐受性降低的主要原因。与此同时,本研究解析了类黄酮响应盐胁迫的分子机制,即在盐胁迫条件下,NtMYB4的表达受到抑制,从而降低了其对NtCHS1基因的抑制作用,NtCHS1基因表达上调,烟草主要的类黄酮物质芸香苷大量积累。芸香苷具有较强的活性氧清除能力,大量积累后植物细胞内的活性氧被有效清除,从而减轻了盐胁迫下活性氧积累对植物细胞的损伤,维持了植物的正常生存。(4)为进一步研究NtMYB4响应各种逆境胁迫的分子机理,本研究利用酵母双杂交文库筛选技术,筛选可能与NtMYB4互作的转录因子。本研究共筛选到8个与NtMYB4结合的转录因子,分别是C2H2-like zinc finger protein、AtbHLH036、HAT14、SPL12、HB-7、MYB60 和 AGL75。下一步的工作将围绕这些转录因子与NtMYB4之间的互作及相互作用展开。