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[背景与目的]结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一。获得持续的增殖信号有助于肿瘤的发生和发展。近年来越来越多的研究表明,非编码RNA在调控肿瘤细胞增殖方面方发挥重要作用。微小RNA(micro RNA,miRNA)和环状RNA(circular RNA,circRNA)是两类重要的非编码RNA,因此本论文将研究这两类非编码RNA在调控结直肠癌细胞增殖能力的生物学功能和机制。[方法和结果]1.采用实时荧光定量PCR和原位杂交方法检测38例结直肠癌组织和癌旁正常对照组织中miR-9的表达,结果发现相比癌旁正常组织,结直肠癌组织中miR-9呈低表达,Kaplan-Meier生存分析显示低表达miR-9的患者预后差(P=0.035)。2.采用慢病毒包装的pre-miR-9表达质粒上调HCT116和HT29细胞中miR-9表达,CCK-8细胞增殖实验和克隆形成实验显示上调miR-9后CRC细胞增殖受抑制(P<0.05)。采用annexin V/7-AAD检测上调miR-9对HCT116和HT29细胞凋亡的影响。流式细胞仪检测发现上调后CRC细胞凋亡率比对照组高(P<0.05)。3.研究发现上调miR-9后UHRF1的表达降低,采用miR-9抑制剂抑制miR-9后,UHRF1恢复表达。4.为了探讨miR-9与UHRF1的关系,我们利用生物信息学软件miRanDa和TargetScan预测miR-9结合的靶基因是UHRF1。双荧光素酶报告实验证实与miRNA对照组相比,miR-9使野生型UHRF1 3’-UTR质粒中相对荧光活性降低,但是在UHRF1 3’-UTR突变型中荧光活性没有变化,证实miR-9可以结合3’-UTR抑制UHRF1的表达。5.采用免疫组化方法检测38例CRC患者癌和癌旁正常组织UHRF1表达水平。14例癌组织呈阳性表达(36.8%),正常组织中4例呈阳性(10.5%),癌组织中UHRF1表达水平显著高于正常组织,阳性染色主要集中在细胞核。Kaplan-Meier生存分析显示癌组织UHRF1高表达的患者5年总体生存率显著低于低表达UHRF1的患者(P=0.002)。6.采用RT-PCR检测15例患者癌组织中UHRF1的表达,结果显示UHRF1在癌组织中高表达(P<0.05),Spearman相关分析发现UHRF1的表达与miR-9呈负相关(r=-0.606,P=0.0004)。7.本课题还研究了环状RNAs与结直肠癌细胞增殖的相关研究。采用环状RNA芯片鉴定3对结直肠癌癌组织和癌旁正常对照组织的差异表达谱。结合小样本预实验结果确定circ-BANP为研究目标。采用qRT-PCR检测circ-BANP在35例结直肠癌患者癌组织和癌旁对照组织中的表达规律。结果显示circ-BANP在结直肠癌组织中表达高于癌旁正常对照(P<0.05)。采用原位杂交实验(ISH)检测10例circ-BANP的表达和亚细胞定位,同样发现circ-BANP在CRC癌组织中的表达高于癌旁,且表达主要位于胞浆。8.干扰cir-BANP后检测细胞生物学功能变化。采用CCK-8检测细胞增殖活力,发现转染组细胞相比对照组增殖均受抑制,克隆形成数减少(P<0.05)。采用qRT-PCR和Western blot检测转染后BANP水平,发现与对照组相比,circ-BANP转染对亲本基因的表达没有影响(P>0.05)。9.通过生物信息学软件预测发现circ-BANP含有3个has-miR-874结合位点。于是采用双萤光素酶报告基因检测实验进一步确认circ-BANP与miR-874是否有特异性的结合关系。circ-BANP+miR-874 mimic 组与circ-BANP+miRNA-NC组相比,荧光活性也是显著下降。circ-BANP+miR-874 inhibitor组与空白对照相比较,荧光活性显著上升,与circ-BANP+miRNA inhibitor-NC组相比同样升高(P<0.05),说明miR-874 inhibitor能封闭miR-874与circ-BANP结合位点从而导致荧光活性改变。在转染克隆有mut-circ-BANP 质粒的实验中,mut-circ-BANP+miR-874 mimic 组与空白组和mut-circ-BANP+miRNA inhibitor-NC 组比较,无统计学差异,提示 miR-874能特异性的结合到circ-BANP上。10.采用pull-down实验进一步验证circ-BANP和miR-874的结合关系。qRT-PCR检测 pull-down circ-BANP 水平,结果发现 Bio-miR-874拉下的 circ-BANP是对照组的4.32倍(P<0.05)。为了直观的检测circ-BANP和miR-874的相互结合,采用原位杂交共定位实验验证circ-BANP和miR-874在细胞内的空间表达关系,结果显示circ-BANP和miR-874在胞内共定位,进一步提示circ-BANP和miR-874存在结合关系。[结论]本课题检测了 miR-9和circ-BANP在结直肠癌组织和癌旁正常对照组织之间的表达差异,同时采用了不同方法验证了非编码RNA miR-9和circ-BANP发挥调控结直肠癌细胞增殖的生物学功能和机制,本研究将为结直肠癌诊断和治疗提供新的潜在靶标。