大肠癌是常见的恶性肿瘤，占所有癌症的9％—15％。大肠癌的发病过程一般较长，从正常上皮、增生、腺瘤、原位癌到转移，有明显的阶段性。大肠癌发生发展的多基因参与、多步骤及多阶段的分子事件模式已明确包括癌基因、抑癌基因、错配修复基因以及细胞周期调控相关因子突变等。但这些仍不能完全解释大肠癌从正常上皮到癌转移的整个过程中的所有分子变化。 为寻找与大肠癌相关的新因素和分子事件，1993年本研究所应用减式探针从正常人的cDNA文库中筛选到正常人肠粘膜组织和肠癌组织中差异表达的新基因ST13，对ST13基因的结构、染色体定位、核酸和蛋白表达及功能所作一系列的研究表明：ST13基因组序列为32017bp，有12个外显子、11个内含子；核酸外显子为3127bp，内含子为28890bp；ST13基因定位于染色体22q13区带；其cDNA全长为3145bp，ORF编码一个由369个氨基酸组成的蛋白质；ST13基因在不同肿瘤细胞系及组织中表达不一，大肠癌组织中mRNA表达低于正常粘膜，但是不同方法研究ST13基因表达与临床病理特征的关系得出的结论并不一致；ST13蛋白主要分布于上皮，为细胞浆蛋白质，在多种组织有不同程度的表达；体内研究提示它可能与细胞生长和转移有关。 随后不久，美国Hartl研究组报道(Cell，1995)了一个与Hsc70相互作用的蛋白HIP(Hsc70-interacting protein)，明确其为一分子共伴侣蛋白，参与调节分子伴侣——真核细胞热休克蛋白Hsc70。HIP可与Hsc70的ATPase结构域结浙江大学博士学位论文合，帮助稳定Hsc70的ADP构象，使Hsc70高亲和底物蛋白，从而参与Hsc70与不同靶蛋白的相互作用。1996年，Smith研究小组从网状细胞裂解液中分离出P48蛋白，可与Hsp70、Hspgo、Hsp6o等结合，参与形成孕激素受体。根据序列分析，ST13与HIP、P48为同一蛋白分子。进一步研究明确了ST13分子存在多个分子功能区:N一端功能区、TPR(tetratrieopeptide repeats)功能区、GGMP重复序列、C端的p60/Stil区等。据此推测ST13蛋白具有与多种细胞凋亡子相互作用的潜在分子特性，可能为一新的凋亡子，对细胞凋亡的整体平衡起至关重要的调控作用。 本研究目的为:研究万刀3基因在大肠癌组织和正常配对组织中mRNA表达情况，明确S刀了基因表达与大肠癌临床病理特征之间的关系;研究S刀3基因和蛋白功能，明确S刀3是否参与细胞凋亡调控及可能作用机理。具体研究内容如下:1.用荧光定t pCR方法检侧SrIJ基因在大肠盛组级和细脑系中的裹达 用Real一time PCR方法检测50对大肠癌组织和正常配对大肠组织S刀3基因mRNA表达，另外检测了四株大肠癌细胞(SW480、SW62O、Lsl74T、RKO)和l株正常肠上皮细胞(N工C)的万刀3基因mRNA表达。结果表明ST13基因在大肠癌中的表达低于配对正常组织，差异有显著性(P<0.05)。ST13基因表达与肿瘤组织分化程度、组织分期程度、有无淋巴结转移、癌组织侵润程度等差异没有统计学意义。SW620细胞STj了基因表达最低，SW480和RKO细胞表达居中，Lsl74T和NIC细胞表达较高。2.用anti s.ns。转染法研究SnJ基因功能 构建antisense转染质粒peDNA3.l一/ST13，转染K562细胞后用G418筛选出6株克隆细胞和1株空载体对照细胞。K562细胞在antisense转染后，6个克隆细胞株中只有K5细胞ST13蛋白表达knockdown约40%，K5细胞对泰素和阿霉素的药物敏感性增加，相同浓度药物作用下，K5细胞存活率较空载体对照明显下降;细胞周期阻滞于GZ/M期。3.用引洲^技术研究STIJ鑫因功能 化学合成3种SIRNA，转染K562细胞后ST13蛋白表达knoekdown约40%，细胞对泰素和阿霉素的药物敏感性增加，相同浓度药物作用下，细胞存活率明显下浙江大学博士学位论文降;细胞周期变化不明显，GZ/M期略有上升;培养第6天细胞自发凋亡率对照为1.55%，siRNAI、siRNAZ、siRNA3分别增加到7.36%、14.5%和8.44%。另外构建瞬时表达siRNA质粒载体psileneerl.0 U6/ST13，细胞ST13表达knockdown不明显，细胞对药物敏感性略有增加，细胞周期无明显变化。4.sT13受白功能的研究 用免疫共沉淀方法明确HSp70是否与ST13相互作用，western一blot验证免疫共沉淀产物，结果表明ST13蛋白可与Hsp7O相互作用。观察细胞在热休克条件下 (42℃作用1小时、45℃作用10分钟)ST13蛋白表达变化、细胞周期变化及其对药物敏感性变化，结果表明热休克后4小时ST13和Hsp70蛋白表达量明显增加，此时细胞对药物的敏感性降低，细胞周期在热休克前后变化不明显。最后用无细胞重组系统5100，观察加入ST13InAb或GST一ST13后Pro一Caspase3/Caspase3、pro一Caspaseg/Caspaseg、Hsp7o、ST13蛋白的表达量变化，明确sT13蛋白是否参与细胞凋亡，结果表明5100在加入ST13mAb后，Hsp70表达量降低，ST13表达降低，Pro一Caspaseg/Caspaseg表达量增高，Pro一Caspase3/Caspase3表达量变化不明显。 结论:1 .5刀3基因在大肠痛中的表达低于配对正常组织，结合临床病理特征统计学差 异不明显。2 .Knockd~K562细胞夕刀3基因后，细胞对药物敏感性增加，细胞自