在生物体内,二氧化硫（SO₂）可产生自含硫氨基酸的分解、硫化氢（H₂S）的氧化等酶促过程。研究发现低浓度的SO₂在血压调节、炎症反应等生理与病理过程中发挥重要的作用。与一氧化氮（NO）分子类似,SO₂也被认为是一种生物气体信号分子。由于SO₂易溶于水形成亚硫酸盐与亚硫酸氢盐,因此其生理作用是通过这类SO₂衍生物实现的。另一方面,SO₂衍生物广泛应用于食品抗氧化剂、抗菌剂,例如SO₂作为葡萄酒的抗菌剂使用等。但是由于现有检测方法的限制,SO₂及其衍生物具体的生理作用及转化过程尚不十分明确。因此,亟待开发高灵敏的、高分辨率的、实时原位的检测方法。荧光分析法具有良好的生物兼容性,在生物及医学领域得到了广泛关注。有机小分子荧光探针具有开发周期短,光稳定性好,细胞毒性低、操作简单及信号直观等优点,近年来得以飞速发展,包括许多基于有机荧光小分子的SO₂衍生物探针也有报道。目前报道的SO₂衍生物荧光探针多是基于单波长荧光强度的变化（增强或减弱）实现检测的。单一信号容易受到测试体系、探针浓度、仪器参数等外界因素的干扰而影响分析结果的准确度。比率荧光探针具有两个荧光发射峰,在SO₂衍生物的作用下,至少一个荧光峰的强度发生变化。通过探针分子内部的相互参照,能有效地消除来自外界因素的干扰,从而提高分析结果的准确度。比率荧光探针一般含有一个荧光基团或者两个不同的荧光基团。单荧光基团的比率荧光探针的信号调控机理主要有分子内电荷转移（ICT）和激发态分子内质子转移（ESIPT）等,双荧光团的比率荧光探针信号的主要调控机理有荧光共振能量转移（FRET）和跨键能量转移（TBET）等。黄酮醇结构是ESIPT型荧光染料的典型代表。黄酮醇由于具有大的Stokes位移,好的生物膜透性和低的细胞毒性而受到广泛关注。基于黄酮醇及其衍生物的荧光探针大多是通过控制其ESIPT过程的"开-关"实现的。FRET过程的实现必须要有两个荧光基团的共同参与,其中一个作为能量供体,另一个作为能量受体。半花菁荧光团具有摩尔消光系数大、荧光量子产率高、可见光有效激发、长波光区域发射、结构容易修饰等特点,有作为FRET体系中能量受体使用的潜质。本论文中,我们致力于研究比率荧光探针的设计、合成与应用。以FRET和ESIPT为主要比率信号变化机理,以半花菁和黄酮醇结构为主要的荧光报告基团,设计合成了四个SO₂衍生物探针以及一个H₂S探针,并研究了它们的荧光性质和在生物检测方面的应用。第一章,简要介绍了荧光探针的基本概念,荧光信号的变化类型及其调控原理;总结了 SO₂衍生物荧光探针的最新进展;综述了基于半花菁和黄酮醇结构的荧光探针的最新进展。第二章,设计并合成了以半花菁为"能量-检测对象"双受体的FRET新模板并应用与SO₂衍生物的比率检测。该FRET体系具有高的能量传递效率与显著的比率特性。同时探针HCy-D可靶向细胞内线粒体,并通过对该细胞内生亚硫酸氢盐的检测,成功区分正常肝细胞（L-02）与癌变的肝细胞（HepG2）。第三章,合成了一例基于FRET新模板的比率荧光及比色探针HCy-NBD,以检测SO₂衍生物。该探针以半花菁基团为受体,以NBD基团为供体,可实现灵敏,快速的检测及裸眼识别。第四章,以FRET模板为基础,引入具有ESIPT过程的黄酮醇基团作为能量供体,从而将ESIPT过程与FRET过程联系起来。由于ESIPT效应,供体黄酮醇分子的Stokes位移高达185 nm;而由于ESIPT与FRET效应的共同作用,受体会产生很大的伪Stokes位移值,故基于该模板的探针在与检测对象作用前后都将体现大的（伪）Stokes位移。探针L-HF1选取对SO₂衍生物有高度反应专一性的半花菁作为能量受体,具有好的选择性与灵敏度。将黄酮醇结构中的羟基转化为酯基以抑制ESIPT过程,所得化合物L-HF2分子中没有检测到FRET过程,这进一步印证了 EISPT对FRET过程的重要辅助作用。同样,该探针可应用于细胞内亚硫酸氢盐的成像,体现了良好的比率特性与低的细胞毒性。第五章,依托ESIPT辅助的FRET模板,为有效减少供体发射峰与受体发射峰的重叠,增加两个荧光发射峰的分辨率,设计合成了探针L-HF3。由于受体荧光团TCF的长波或近红外发射特性,该探针具有更低的荧光检测背景与更小的光谱重叠程度,因此有更大程度的比率荧光变化及更可靠的检测结果。此外,探针L-HF3可有效地检测SO₂有机供体原位生成的SO₂及其衍生物。第六章,基于对ESIPT过程"开-关"状态的调控,以黄酮醇为荧光团,以二硫键与酯基为反应活性位点,设计合成了一例H₂S荧光探针HF-PBA。该探针本身由于ESIPT过程被阻断,只在400 nm波长处有微弱的荧光。H₂S进攻二硫键引发的二步连串反应将具有ESIPT效应的黄酮醇分子游离出来,从而产生酮式（强）与醇式（弱）两个结构的荧光发射峰。该探针具有高的反应活性、高的灵敏度与低的细胞毒性,可应用于细胞内H₂S的成像研究。本论文主要创新点:1.以半花菁、黄酮醇等结构为基础,以FRET、ESIPT与ICT等原理为信号调控方式,以化学反应为识别方式,设计合成了一系列在生理条件下检测SO₂衍生物比率荧光探针及一个H₂S比率荧光探针。并成功地将这些探针应用于细胞内成像研究。2.首次将半花菁荧光基团引入FRET体系中,半花菁作为供体能量及检测对象的受体,构建出新的FRET模板。该FRET模板是通过对受体结构内ICT过程的阻断来实现比率调控的,具有高的能量传递效率以及较大的Stokes位移。通过对细胞内源亚硫酸氢盐的检测,首次揭示了肝癌细胞与正常肝细胞的内源亚硫酸氢盐浓度具有较大差异,为在细胞水平上诊断肝癌提供了新的思路。3.首次将ESIPT过程与FRET过程联系起来,构建了 ESIPT辅助的FRET模板,具有很大的（伪）Stokes位移值与高的能量转移效率,并且丰富了 FRET型比率探针供体的结构多样性。