背景和目的:胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率高居各类恶性肿瘤的前列,严重威胁人类健康。化疗在进展期和转移性胃癌的治疗中具有重要地位。尽管近年来新的抗癌药物不断出现,多数患者仍不能获得有效控制,这其中重要的原因之一就是胃癌细胞对化疗药物产生了耐药性,导致化疗失败。紫杉烷类作为第三代抗癌药物,广泛应用于胃癌等多种肿瘤的治疗,并取得一定的疗效。但临床观察到该药在不同个体表现出来的治疗效果和毒副反应相差较大。因此,探寻出与紫杉醇化疗敏感性相关的生物学预测指标,有利于胃癌化疗方案的制定,同时也能为胃癌个体化治疗提供依据。体外药敏检测技术是一种简便易行能反映肿瘤细胞对化疗药物敏感性的手段,虽然药物在体内外的作用模式存在一定的差异性,但在一定程度上仍可反应肿瘤细胞对药物作用的效应。近年来多项研究发现肿瘤细胞对紫杉醇产生耐药可能与微管蛋白异构体表达异常,微管相关蛋白表达及凋亡抑制蛋白家族高表达引起的凋亡抑制有关。而不同个体对紫杉醇治疗效果的差异可能与上述指标的表达水平不同有关。本实验中我们检测了胃癌细胞中Ⅲ型β-微管蛋白,微管相关蛋白tau及凋亡抑制蛋白survivin三者的基因和蛋白表达,分析其与紫杉类药物敏感性的关系,以探索能够预测胃癌化疗敏感性的分子指标。方法:1.收集54例新鲜胃癌组织,将组织分为两部分:一部分装入盛有PBS的无菌小瓶,然后浸泡于含抗生素的RPMI 1640培养液中15~25 min,12 h内进行ATP-TCA检测;另一部分剪成小块,用锡纸包裹投入-196℃液氮中瞬时冷冻完全后保存于-80℃超低温冰箱中以备后续进行RT-PCR和Western blot检测。除去肿瘤组织表面的结缔组织、纤维和脂肪,将标本剪碎成小碎块,转移至含组织消化液的离心管中,37℃孵育1.5~3 h。过滤消化后的混合液,弃去未消化的组织碎屑。滤过液中加入RPMI 1640培养液,混匀,离心去上清以洗涤细胞。使用Ficoll Hypaque 1.077分离液梯度离心,纯化收集肿瘤细胞。获得单细胞后,染色计数,将悬液浓度调整为2~4×105活细胞/ml。将细胞悬液铺入96孔板,加入一定浓度紫杉醇稀释液,培养5~7天。采用ATP生物荧光法检测培养的胃癌原代细胞对紫杉醇的体外药物敏感性。2.以Trizol提取标本中的总RNA,反转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测胃癌细胞内Class IIIβ-tubulin、MAPT和survivin的mRNA表达水平。3.提取胃癌标本总蛋白,免疫蛋白印迹技术(Western Blot)检测胃癌细胞内Class IIIβ-tubulin、MAPT和survivin的蛋白表达水平。4.分析胃癌细胞对紫杉醇体外敏感性与这三个生物学指标表达的关系。结果:完成的54例标本体外药敏检测结果为:高度敏感6例,部分敏感13例,弱敏感10例,抵抗25例,总体外有效率为53.70%(29/54)。RT-PCR检测结果:Class IIIβ-tubulin的mRNA表达水平为1.04±0.22,与分化程度有关(P = 0.029);MAPT的mRNA表达水平为0.80±0.17;survivin的mRNA表达水平为1.00±0.19,与分化程度有关(P = 0.009)。药敏指数与Class IIIβ-tubulin mRNA(r = -0.372,P = 0.006)及蛋白表达水平(r = -0.350,P = 0.009)呈负相关,与MAPT mRNA(r = -0.292,P = 0.032)及蛋白表达水平(r = -0.289,P = 0.034)呈负相关,与survivin mRNA(r = -0.340,P = 0.012)及蛋白表达水平(r = -0.296,P = 0.030)呈负相关;Class IIIβ-tubulin与MAPT的mRNA(r = 0.284,P = 0.037)及蛋白表达水平(r = 0.440,P = 0.001)呈正相关。结论:1.胃癌细胞中Class IIIβ-tubulin、MAPT和survivin的表达水平对紫杉醇的治疗敏感性可能具有较好的预测价值。2. Class IIIβ-tubulin和survivin的mRNA表达水平与肿瘤组织学分级有明显相关性,未发现Class IIIβ-tubulin、MAPT和survivin的mRNA表达水平与患者性别、年龄、侵犯深度、淋巴结转移之间有明显相关性。3. Class IIIβ-tubulin与MAPT的mRNA及蛋白表达水平呈正相关,两者在肿瘤细胞产生耐药过程中可能存在某种水平的共同调节机制。4. ATP生物荧光法是一项可操作性强、客观性较好的体外药敏检测技术。