利用基因编辑技术可以实现物种自身缺陷基因的去除以及外源基因的稳定整合和特异性表达。将这一技术利用于转基因动物的制备,不仅对于动物改良、动物乳腺生物反应器奠定了一定的基础,同时对于各种疾病研究、疾病模型的建立也具有重要意义。在基因编辑技术中CRISPR/Cas9基因编辑技术是目前应用最为广泛的技术,它使外源基因打靶省时省力,并且使基因编辑成本大大降低,但是CRISPR/Cas9技术实现外源基因多拷贝整合仍然存在技术难点。而Phi C31整合酶自身可介导特定的att位点实现外源基因不可逆插入,并且不仅限于单拷贝整合。将CRISPR/Cas9技术为代表的基因编辑技术与Phi C31整合酶结合起来为外源基因的多拷贝整合提供了新的思路。本研究拟利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将3×att P、6×att P序列和9×att P序列整合到山羊ROSA26基因座,通过药物筛选及Junction PCR鉴定获得相应的阳性克隆细胞并对其功能进行研究。主要结果获得如下:针对ROSA26基因座设计sg RNA,获得体外切割效率高的打靶位点。成功构建带有att P序列的供体载体ROSA26-PURO-3×att P、ROSA26-PURO-6×att P和ROSA26-PURO-9×att P。共转染不同的供体载体和Cas9真核打靶载体至奶山羊成纤维细胞中,用嘌呤霉素筛选获得att P稳定整合的阳性克隆,利用Junction PCR鉴定获得精准整合的阳性单克隆细胞。构建att B-Neo-m Cherry-EF1α供体载体与p CMVInt-Phic31表达载体对整合att P系列的阳性克隆细胞进行二次电转。Edu检测att P稳定整合阳性单克隆和F3奶山羊成纤维细胞,对比表明筛选出克隆细胞增殖活力较高可用于后续奶山羊体细胞核移植从而进行下一步验证。本试验虽然未获得有效的外源基因整合效率,但通过CRISPR/Cas9技术和Phi C31整合酶相结合的方法,对探究外源基因多拷贝整合提供了新的研究方向,也为乳腺生物反应器的发展、家畜基因组探究等提供了新的思路。