论文部分内容阅读
乳房炎（Mastitis）是由自身或外界原因刺激引起乳腺血乳屏障破坏造成的炎症疾病,给奶山羊产业造成了一定的经济损失。目前,抗生素是治疗和预防乳房炎的常用药物,但是抗生素的使用不仅造成耐药菌株的出现,还会造成羊奶中抗生素残留,影响羊奶品质。抗菌肽（antimicrobial peptides,AMPs）是机体自身合成的一类小分子多肽,属于机体非特异性免疫系统的固有组成成分,与抗生素相比,除具有广谱抗微生物活性外,还参与免疫调节,并且无耐药性。因此,抗菌肽在预防和治疗山羊乳房炎中的作用越来越受到关注。抗菌肽S100家族是生物体内合成的小分子多肽,属于机体先天性免疫系统的重要组成之一,其中抗菌肽S100A7作为动物机体固有免疫的重要调节蛋白是否参与山羊乳房炎的病理过程尚不清楚。C型钠肽（C-type natriuretic peptide,CNP）是钠肽家族成员之一,CNP通过与钠肽受体-B（natriuretic peptide receptor B,NPR-B）结合,催化第二信使环磷酸鸟苷（cyclic guanosinc monophosphate,c GMP）生成。CNP/NPR-B信号通路参与调节细胞增殖与凋亡等多种生物学效应。已有研究示,CNP本身可能也是一种免疫调节因子,参与炎症反应。但在山羊乳房中CNP及其受体NPR-B是否表达未见报道,以及CNP在山羊乳房中调节抗菌肽S100A7合成和分泌的机制尚不清楚。本研究主要利用山羊乳腺上皮细胞（Goat mammary epithelial cells,GMECs）为体外研究模型,研究CNP信号通路对山羊乳腺上皮细胞S100A7的合成和分泌的影响,揭示CNP信号通路调控山羊乳腺上皮细胞合成和分泌S100A7的机制,为研究S100A7的表达调控机理供新的理论基础,为证明CNP是一种免疫调节因子供新的证据,也为S100A7作为山羊乳房炎诊断和治疗的候选多肽供理论和试验证据。研究内容与研究结果如下:（1）免疫组化技术检测到在山羊乳房中,CNP主要表达于乳头皮肤和乳头管的表皮层,而在乳腺组织中不表达。NPR-B主要表达于乳头皮肤和乳头管的表皮层,也表达于乳腺组织腺泡上皮细胞中。（2）利用乳腺组织块培养法分离GMECs,GMECs具有典型的乳腺上皮细胞样形态。绘制GMECs生长曲线,生长曲线在6代内呈“S”型,符合正常体细胞生长规律;采用免疫荧光染色发现此细胞群表达乳腺腺上皮细胞的标志角蛋白18（Cytokeratin-18,CK-18）而不表达乳腺肌上皮标志角蛋白14（Cytokeratin-14,CK-14）;RT-PCR技术检测到分离的GMECs能够表达β-酪蛋白;经泌乳培养基诱导,油红O染色后观察其胞质内能够合成大量脂滴,证明分离培养的GMECs是增殖能力较强,且保留泌乳能力的乳腺上皮细胞。（3）采用免疫荧光染色、RT-PCR与Western Blotting技术,研究钠肽系统在GMECs的表达及细胞定位。RT-PCR结果进一步证明GMECs表达NPR-B受体和BNP（B-type natriuretic peptide）,而不表达NPR-A（natriuretic peptide receptor A）,NPR-C（natriuretic peptide receptor C）,ANP（A-type natriuretic peptide）和CNP。免疫荧光染色和Western Blotting结果显示至少10代内GMECs能够稳定表达NPR-B蛋白。（4）采用CCK-8活力检测、流式细胞术检测细胞周期的方法确定CNP对GMECs细胞增殖的影响。CCK-8结果显示CNP不影响GMECs细胞活力,流式细胞术结果显示CNP不影响细胞周期分布;采用TUNEL染色和Annexin V-FITC/PI双染法检测CNP对GMECs细胞凋亡的影响,结果显示CNP不影响GMECs细胞凋亡;采用油红O染色、吸光度分析检测CNP对GMECs脂质合成的影响,结果显示CNP在泌乳培养基的培养体系下不影响GMECs的脂质合成;采用Western Blotting和ELISA技术检测CNP对S100A7表达的影响,结果显示CNP上调S100A7的表达和分泌,且CNP上调GMECs抗菌肽S100A7的分泌呈时间依赖性。（5）利用免疫组化技术检测健康山羊和乳房炎患羊乳房中CNP、NPR-B和S100A7在乳头和乳腺组织的表达与定位。结果表明健康山羊和乳房炎山羊的乳腺腺泡上皮细胞中均无CNP的表达;健康山羊和乳房炎患羊的乳头组织中NPR-B和S100A7主要表达于乳头皮肤和乳头管的表皮细胞,以及乳腺组织的腺泡上皮细胞中,且乳房炎山羊乳腺组织中NPR-B和S100A7的表达显著高于健康山羊乳腺组织。（6）利用ELISA技术,检测CNP对GMECs胞内c GMP含量的影响,结果表明:CNP可上调GMECs胞内c GMP水平且呈时间和剂量依赖性。利用ELISA和Western Blotting技术,检测在有或无KT5823（PKG特异性拮抗剂）存在的条件下,检测CNP对GMECs S100A7合成和分泌的影响,结果进一步证明CNP通过CNP/NPR-B/PKG信号通路影响S100A7的合成和分泌。