背景:类风湿关节炎是一种累及周围关节为主的多系统炎症性自身免疫疾病,其特征的表现为对称性、多个周围关节的慢性炎症病变,其基本病理改变为慢性滑膜炎,然而其确切的病因尚不清楚,其致炎过程极为复杂,是由多种细胞因子、黏附分子和趋化因子等参与的复杂的免疫过程,是多基因协同作用的结果。随着人们对RA抗体谱的不断深入认识,提出了瓜氨酸相关自身免疫系统概念,此系统可能在RA的发病和发展过程中起重要作用,并且与病情和预后有关。研究表明,AKA、抗CCP抗体与RA关节侵蚀密切相关。瓜氨酸由精氨酸代谢而成,是人体中非自然氨基酸。催化肽中精氨酸残基转化成瓜氨酸残基的过程叫做瓜氨酸化。瓜氨酸化由肽基精氨酸脱亚胺酶（peptidylargininedeiminase,PADI）完成。目前,在人体组织中共发现了五种PADI（即PADI1、2、3、4和6）。它们都簇集在染色体1p36.1上,并具有不同的组织分布。与RA病呈最强连锁状态的是肽基精氨酸脱亚胺酶4（PADI4）。角蛋白组成一些水溶性的蛋白质,它们构成了大多数上皮细胞的中间纤维。到目前为止,已有超过20种人的角蛋白被鉴定,它们可分为酸性和碱性两种亚型,酸性（tapeⅠ）亚型包括（Mol.Wt:40,45,46,48,50,51,55 and 56.6 kDa）,碱性亚型（typeⅡ）包括（Mol.Wt:52,56,58,59,64 and 65-67 kDa）角蛋白在疾病发病过程、细胞分化和调亡过程中起重要的作用。角蛋白的翻译后修饰如糖基化、磷酸化和谷氨酰胺化可影响细胞的生理过程并介导细胞的发展。AKA对于类风湿关节炎具有高度的特异性,约有30-80%的类风湿关节炎的病人血清中可检测到这种抗体,并且它与关节破坏和疾病的活动密切相关。然而,细胞角蛋白与抗角蛋白抗体是否具有直接的生化和免疫学联系尚不清楚。Vincent等也揭示AKA与自然产生的自身抗上皮细胞角蛋白抗体不同。尽管以上研究提示角蛋白并不是AKA的真正的目标,是否在类风湿滑膜中的存在细胞角蛋白或它的新的结构尚未见报道。本研究即从这一角度出发探讨细胞角蛋白在类风湿关节炎滑膜组织中的瓜氨酸化及其表达,同时我们还要探讨细胞角蛋白在类风湿关节炎发病机制中的可能作用。目的:研究细胞角蛋白在类风湿关节炎滑膜组织中的瓜氨酸化及其表达,探讨细胞角蛋白在类风湿关节炎发病机制中的可能作用。方法:1.收集行外科手术的12例类风湿关节炎滑膜组织,28骨关节炎滑膜组织,9例因外伤而行手术的正常患者滑膜组织,常规石蜡包埋和制备组织切片。2.采用免疫组织化学分析、双免疫荧光标记分析、免疫沉淀和Western blot分析方法,检测滑膜细胞膜是否存在瓜氨酸化的细胞角蛋白,探讨其在类风湿关节炎发病机制中的作用。（1）免疫组织化学分析:滑膜组织按照标准操作规程去石蜡和再水化,组织切片经蛋白水解酶消化预处理并用蒸馏水冲洗后,置PBS液中。然后组织切片与细胞抗角蛋白单克隆抗体AE1/AE3（Chemicon,USA）共同孵育。组织切片与第一个抗体4℃下孵育过夜,然后用PBS液洗去未反应多余抗体。用UltraSensitiveTM S-P试剂盒行免疫组化检测。（2）双免疫荧光标记分析:组织切片如前述方法处理,然后与单克隆的抗角蛋白抗体和兔的抗瓜氨酸化蛋白抗体4℃孵育12h,在与抗MC孵育前,组织切片首先置于由试剂盒提供的修饰缓冲液中。在强酸环境中修饰蛋白的瓜氨酸残基形成脲基加合物,它能确保检出含有瓜氨酸的蛋白而对附近的氨基酸顺序没有影响。第二种抗体为异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG（H L）和Cy^TM5标记的羊抗兔IgG（H L）（Zymed,USA）,分别作用于单克隆抗体和兔多克隆抗体。组织切片室温下孵育40 min,然后用荧光显微镜观察。（Nikon 50i,Japan）.（3）免疫沉淀和Western blot分析:利用总蛋白提取试剂盒（Biochain,USA）按照说明书对类风湿关节炎（n=5）和骨关节炎（n=5）滑膜组织总蛋白进行纯化。利用蛋白G免疫沉淀试剂盒对标本蛋白质中的角蛋白按照进行免疫沉淀。蛋白样品（5μg）用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后利用Western blot仪转至PVDF膜上。膜给予抗角蛋白或抗MC抗体的探针标记,并用ECL Western Blotting参照说明进行检测。免疫信号检测采用Typhoon high performance gel and blot imager（Amersham）系统。结果:类风湿关节炎滑膜组织中存在瓜氨酸化的细胞角蛋白,同时也提示细胞角蛋白在类风湿关节炎发病机制如异常细胞的增值、凋亡和自身免疫应答中可能起重要作用。结论:类风湿关节炎滑膜组织中存在瓜氨酸化的细胞角蛋白,细胞角蛋白在类风湿关节炎发病机制中可能起重要作用。背景类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一个累及周围关节为主的多系统性炎症性的自身免疫性疾病,其特征性的症状为对称性、周围性炎症性病变,临床表现为受累关节疼痛、肿胀功能下降,病变呈持续、反复发作过程,我国的患病率约为0.3%～0.6%,其基本病理改变是滑膜炎,然而病变并非局限于关节,肺有丰富的结缔组织和血液供应,是经常受累的脏器之一,近年来对肺间质病变（interstitial lung disease,ILD）的研究越来越受到关注。类风湿关节炎肺间质病变（RA-ILD）早期因无明显临床症状体征而经常被忽略,晚期出现肺纤维化预后极差,可因呼吸衰竭而死亡。然而其作用机制尚不清楚,因此,深入研究类风湿关节炎肺间质病变的发病机制、为其早期诊断和治疗提高理论依据具有重要的意义。本研究结合类风湿关节炎的临床特点、结合肺部影像学、肺功能和动脉血气分析结果,分析RA和RA-ILD病人血清细胞因子转化生长因子-β1、肿瘤坏死因子-α、胰岛素样生长因子-和PDGF-AB血小板源性生长因子-AB)的变化规律。目的;探讨类风湿关节炎肺间质纤维化的临床特点、肺部HRCT、肺功能、动脉血分析的改变和血清细胞因子转化生长因子β1（TGF-β1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）和血小板源性生长因子-AB（PDGF-AB）的变化规律,讨论其可能的发病机制。方法:65例类风湿关节炎病人来自我院风湿科门诊和病房,30例RA合并肺纤维化,其中男3例,女27例,平均年龄48.2±12.6岁,病程4～18年,平均病程9.7±4.8年。;35例RA无肺纤维化,其中男4例,女31例,平均年龄35.4±7.5岁,病程3～14,平均病程4.5±5.3年。实验组病例均符合美国风湿病学会（ACR）1987年RA分类标准。主要观察指标有性别、年龄、病程、收缩压、舒张压、呼吸次数,休息痛、病人评价、医生评价,晨僵时间、握力、压痛关节数、压痛关节指数、肿胀关节数、肿胀关节指数,关节功能评价,手X线分期,日常生活能力（HAQ）、肺部HRCT、肺功能、动脉血分析等。所有病人均空腹抽血5ml,分离血清,-70℃冻存,测定其血清中血清细胞因子TGF-β1（转化生长因子-β1）、TNF-α（肿瘤坏死因子-α）、IGF-1（胰岛素样生长因子-1）和PDGF-AB（血小板源性生长因子-AB）浓度。结果:RA和RA-ILD病人主要临床表现分析显示两组病人在年龄、病程、休息痛、病人评价、医生评价、晨僵、握力、压痛关节数、压痛关节指数、肿胀关节数、肿胀关节指数、关节功能、手X线分期、日常生活能力等方面存在明显的差异（P<0.05或0.01）。与RA组相比,RA-ILD组病人年龄大、病程长,休息痛、病人评价、医生评价较重,晨僵时间长,握力小,压痛关节数、压痛关节指数、肿胀关节数、肿胀关节指数均较高,关节功能评价和手X线分期较严重,日常生活能力较差（P<0.01）。主要实验室检查指标与RA组相比,RA-ILD组病人明显的表现为血沉较快、C反应蛋白高、类风湿因子滴度高、球蛋白含量高、肺动脉压高等（P<0.01）。RA-ILD病人主要呼吸系统表现有咳嗽、咳痰、胸闷、气短、胸痛、呼吸音改变、Velcro啰音、活动后呼吸困难等。肺HRCT扫描结果显示RA-IL病人肺部损害的HRCT表现主要有小叶间隔增厚、叶间胸膜肥厚、胸壁胸膜肥厚粘连、支气管壁增厚、马赛克征、支气管扩张、肺气肿、磨玻璃样改变、斑片状阴影、蜂窝样改变、小结节影、纤维瘢痕等。病变多分布于双肺中、下野。肺功能检查结果显示RA和RA-ILD病人在VC、FVC、MMF和DLCO指标存在明显差异（P<0.01）。RA-ILD病人主要表现为弥散功能下降（25/30,83.3%）、限制性通气障碍（19/30,63.3%）,阻塞性通气障碍（8/30,26.7%）、小气道功能受损（13/30,42.3%）,混合性肺功能障碍（5/30,16.7%）。动脉血气分析结果显示,Ph和PCO2两组无差别,而PO2RA-ILD组明显低于RA组,有显著性差异（P<0.01）,说明RA-ILD病人有明显的低氧血症。血清细胞因子测定结果显示,与正常对照组相比,RA-ILD病人血清细胞因子TGF-β1、TNF-α、IGF-1、PDGF-AB水平明显增高（P<0.01）,RA病人上述细胞因子也明显升高（P<0.01）。与RA病人相比,RA-ILD病人血清细胞因子水平TGF-β1、TNF-α、IGF-1、PDGF-AB也明显增高（P<0.01）。结论:类风湿关节炎肺间质病变病人多项临床活动指标较类风湿关节炎无肺间质病变病人严重,肺部HRCT有明显的小叶间隔增厚、叶间胸膜肥厚、胸壁胸膜肥厚粘连、支气管壁增厚、蜂窝肺等影像学改变;肺功能检查RA-ILD病人主要表现为弥散功能下降、限制性通气障碍,阻塞性通气障碍、小气道功能受损和混合性肺功能障碍;动脉血气分析可有低氧血症;血清细胞因子水平TGF-β1、TNF-α、IGF-1明显增高（P<0.01）。背景TGF-β在肺纤维化的形成与发展中起关键性作用,研究发现,肺泡炎渗出液中有多种细胞生长因子,它们表达的种类、作用浓度和高表达的时间差异以及其相应受体激活程度,对肺泡上皮修复或肺纤维化的发生至关重要,其中TGF-β1是人们关注的热点之一。在各种实验模型和临床纤维化疾病中,TGF-β1持续上升,抑制它的生物活性会抑制基质生成和调节纤维化过程。TGF-β1的生物学功能:①趋化并促进成纤维细胞分裂增殖及成熟分化。TGF-β1可以促进培养的间质细胞如成纤维细胞及成骨细胞的增殖,在人类成纤维细胞WI38,TGF-β1可以负调节p21的合成并激活周期素E-cd k2激酶活性。②刺激成纤维细胞大量合成胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型,尤其是Ⅳ型胶原蛋白,以增加肺间质的胶原成分,同时又抑制胶原蛋白酶及纤溶酶原激活物的合成,增加蛋白酶抑制物的形成,以减少肺间质ECM的降解,造成ECM调节失控。③抗炎作用TGF-β1可通过调节免疫系统来抑制B淋巴细胞和T淋巴细胞,同时通过NO产生对巨噬细胞的细胞毒性。④抑制细胞外基质自身的稳定。百草枯已有40多年历史,现在它是世界上使用最广的除草剂之一,分子式为C12H14N2Cl2:分子量:257。百草枯又名克芜踪,接触土壤后迅速失活,它是一种非选择性、接触性除草剂,它具有极强的置肺纤维化作用,口服中毒以肺损伤较明显,可导致呼吸困难、急性肺水肿、进行性肺纤维化等,晚期病人几乎无例外的发生肺纤维化。目的利用百草枯诱导制备肺纤维化动物模型,观察TGF-β1在肺纤维化过程中的动态变化规律,探讨TGF-β1在肺纤维发病中的作用机制。方法健康雄性Wistar大鼠50只,适应性饲养一周后,随机分为对照组、染毒3天组、7天组、14天组和21天组,染毒组按50mg/kg剂量比配置百草枯悬液染毒,染毒组给予相应剂量的百草枯溶液1ml灌胃,对照组同时给予1ml蒸馏水,实验分3天、7天、14天和21天三个时间段进行观察。2.各染毒组动物均于观察结束后采用下腔静脉穿刺取血约5ml,静置20min,离心后取血清,-70℃冰箱冻存,待检测,分离并结扎右肺支气管,生理盐水2ml灌洗左肺,连箱冻存。左肺灌洗后,肺组织置-70℃冰箱冻存,制备肺组织匀浆。取右肺,部分冰盐水续3次,收集支气管肺泡灌洗液（BAL）,离心后取上清夜,与血清一起置于-70℃冰洗涤后置于由大连宝生物提供标本存储液中封存,待Real timequantitative PCR组织检测。部分留取常规病理和电镜标本。死亡动物于频死前采血采取上述措施留取标本。血清、支气管肺泡灌洗液、肺组织匀浆TGF-β1的检测参照senxiong公司试剂盒有关说明进行3.肺组织TGF-β1采用实时荧光PCR（Real Time quantitative PCR）方法按照试剂盒说明步骤进行。结果百草枯染毒诱导3天后动物血清、BALF、肺组织匀浆TGF-β1明显升高,7天、14天和21天仍然维持在较高水平。而肺组织TGF-β1B表达染毒后3天、7天、14天均明显增多,而至21天则出现下降的趋势。常规病理和Masson染色观察发现,诱导3天后肺充血、水肿明显,有大量炎性细胞浸润,7天后开始出现肺纤维增生表现,14天后肺纤维增生明显,21天出现典型的肺纤维化表现。电镜观察百草枯诱导3天后可见高度水肿的Ⅰ型上皮细胞局部坏死剥离,基膜裸露。Ⅰ型上皮细胞出现广泛部,分崩解坏死,基膜断裂,肺泡腔内充满大量蛋白颗粒和细胞碎片。Ⅱ型上皮细胞数量明显增多,胞浆内有大量核糖体、粗面内质网和肥大增多的板层小体。7天、14天、21天诱导组逐渐出现局部基膜卷折,肺泡塌陷,间质胶原纤维增多,局部纤维化逐渐明显。呼吸膜出现分层、扭曲甚至破坏;Ⅱ型细胞绒毛减少甚至消失,板层小体大部分缺失呈空泡状;肺间质大量纤维堆积,排列紧密而凌乱。结论百草枯诱导可建立典型的肺纤维化动物模型。转化生长因子-β1在肺纤维化形成过程中明显升高和持续表达,提示它在肺纤维发病机制中可能起到重要作用。背景重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（rhTNFR:Fc,Etanercept）是一种采用重组DNA技术生产的融合蛋白。它可以特异性地阻断TNF-α与其细胞表面受体的相互作用,用来治疗类风湿关节炎（RA）、强直性脊柱炎（AS）和银屑病关节炎（PsA）具有较好的疗效,可迅速控制症状。Etanercept于1998年在美国由FDA批准上市,它是一种完全人化的重组可溶性TNF p75受体二聚体融合蛋白,与内源性的可溶性受体相似,相对分子质量为150 000,在人体的半数清除时间为（102±30）h。该药与血浆中可溶性TNF-α以及细胞膜表面的TNF-α高亲和结合并中和其作用,使TNF-α的生物活性丧失,它还可以和TNF-β结合,后者与TNF-α有相似的生物活性,在机体的免疫功能尤其是淋巴器官的形成和炎症过程中发挥作用,但是Etanercept结合TNF-β并产生抑制作用与临床疗效的关系还不清楚。百草枯化学上属联吡啶杂环化合物,对人毒性却较高,全身中毒可引起多系统损害,尤以肺损害较严重,可引起肺充血、出血、水肿、透明膜形成和变性,很快形成肺纤维化,病人多死于肺纤维化引起的呼吸衰竭。我们用百草库成功地建立了急性肺损伤/肺纤维化动物模型。近年来,肺泡巨噬细胞及其他肺结构细胞合成的各种细胞因子如转化生长因子-β（transforming growthfactor-beta,TGF-β）,肿瘤坏死因子（tumor neciosis factor,TNF）等在肺纤维化机制研究中取得了非常重要的进展,抗细胞因子生物学作用的细胞因子拮抗剂及阻止肺成纤维细胞增殖及过度分泌胶原的抗纤维化药物在理论上可干预肺纤维化的形成和发展。探讨多个细胞因子共有的细胞内信号传导途径并加以阻断已经为肺纤维化的治疗开辟了一条新的途径。本研究即从这一角度出发。利用我们建立的动物模型来探讨Etanercept联合甲基强的松龙对急性肺损伤的治疗作用。目的探讨Etanercept联合甲基强的松龙对急性肺损伤的治疗作用。方法健康雄性Wistar大鼠50只,随机分为百草枯50mg/kg诱导组10只、百草枯50mg/kg诱导+甲强龙治疗组10只,百草枯50mg/kg诱导+Etanercept治疗组10只,百草枯50mg/kg诱导+甲强龙+Etanercept治疗组10只,正常对照组10只,21天处死,留取标本即可。40只诱导大鼠全部于第1天灌胃诱导1次,诱导方法是将20%的百草枯除草剂用蒸馏水适当稀释至1ml,配制终浓度分别为50mg/kg的溶液灌胃,正常对照组同时给予1ml蒸馏水灌胃。治疗组于诱导1小时候开始治疗,方案为甲基强的松龙10mg/kg,稀释后,鼠尾静脉注射,一天一次,连用3d后改为5mg/kg,稀释后鼠尾静脉注射,一天一次,用至第20天。肿瘤坏死因子拮抗剂0.5mg/kg,每周2次,皮下或肌肉注射,分别于诱导后第1d、4d、8d、11d、15d、18d给予。各组动物均于21d观察结束后采用下腔静脉穿刺取血约5ml,静置20min,离心后取血清,-70℃冰箱冻存,待检测,分离并结扎右肺支气管,生理盐水2ml灌洗左肺,连续3次,收集支气管肺泡灌洗液（BALF）,离心后取上清夜,与血清一起置于-70℃冰箱冻存。左肺灌洗后,肺组织置-70℃冰箱冻存,制备肺组织匀浆。取右肺,部分冰盐水洗涤后置于由大连宝生物提供标本存储液中封存,待Real time quantitative PCR组织检测。部分留取常规病理和电镜标本。死亡动物于频死前采血采取上述措施留取标本。血清、BALF、肺组织匀浆中细胞因子TNF-α、TGF-β1的检测参照senxiong公司试剂盒有关说明进行,美国R&D公司进口分装。结果百草枯诱导后大鼠血清、支气管肺泡灌洗液、肺组织匀浆中TNF-α、TGF-β1含量明显升高,肺组织TNF-α、TGF-β1 mRNA明显增加,与对照组比较差异显著（P<0.01）。Etanercept联合甲基强的松龙治疗、单独甲强龙治疗、单独Etanercept治疗均能降低大鼠血清TNF-α、TGF-β1浓度,其疗效大小顺序为甲强龙+Etanercept治疗组>甲强龙治疗组>Etanercept治疗组,差异显著（P<0.05或0.01）。病理显示治疗组肺纤维化程度明显减轻,其疗效大小顺序依次为甲强龙+Etanercept治疗组>甲强龙治疗组>Etanercept治疗组。结论Etanercept联合甲基强的松龙能明显降低实验动物血清、支气管肺泡灌洗液和肺组织中TNF-α、TGF-β1含量,也明显降低肺组织TNF-α、TGF-β1mRNA的表达,降低肺损伤导致的肺纤维化的程度,因此具有较好的疗效。