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据世界卫生组织（WHO）估计,全世界约有三分之一的人口感染了结核分枝杆菌。2009年,全球新发结核病例940万例,死亡170万例,结核病仍然是全球公共卫生安全的重大威胁[1]。虽然结核病的发病率只有5%到10%,但由于庞大的感染人群,结核病现在仍然是仅次于艾滋病的全球第二大感染性疾病。从目前的流行趋势来看,至2020年,结核病仍然会居于全球最严重的十大疾病之列。亚洲主要发展中国家,例如印度、中国、巴基斯坦和印度尼西亚集中了全球50%以上的结核病例,结核病防控形势严峻。因此,对结核病致病机制的阐明进而为抗结核新药和新疫苗开发奠定理论基础就显得尤为重要。海分枝杆菌是近年来发展起来的研究结核分枝杆菌致病性的模式生物[2-10]。为了分离和鉴定海分枝杆菌新的毒力因子,我们通过对海分枝杆菌转座子突变库的筛选,我们得到了一些菌落形态发生改变的菌株,对菌株的插入位点进行鉴定后发现,有三株突变株的转座子插入位点均位于同一基因内。这一基因为海分枝杆菌的ppe38（MMAR3661）基因,与结核分枝杆菌ppe38（Rv2352c）基因的DNA序列相似性为82%,与PPE38蛋白的氨基酸序列相似性为73%。PE （proline-glutamic acid）和PPE （proline-proline-glutamic acid）家族蛋白是分枝杆菌特有的蛋白,在致病性分枝杆菌中广泛存在。前人的研究表明,这类蛋白可能定位于细胞壁或分泌到胞外,但它们在结核分枝杆菌致病性中发挥的功能还有待研究[11-19]。本研究对海分枝杆菌ppe38突变菌株的细菌生物学表型研究发现,突变株不仅菌落形态发生显著改变,细菌沉积速率提高,迁移速率显著降低,不能形成生物膜。所有的生物学表型在互补表达海分枝杆菌或结核分枝杆菌的PPE38蛋白后,都完全回复。Western blot结果发现,PPE38蛋白定位于分枝杆菌细胞壁。更有意思的是,PPE38突变后,海分枝杆菌典型的索状结构特征消失。由于结核分枝杆菌致病菌H37Rv具有典型的索状结构,而非致病菌H37Ra不具有索状结构,所以几十年来,索状结构被认为是致病性分枝杆菌的典型结构[20]。而以往发现的与索状结构形成相关的因子,均参与细胞壁脂质成分的合成。PPE38是一个新发现的索状因子,证实了细胞壁蛋白在细菌索状结构中起到的关键作用。PPE38暴露于细胞壁表面提示其极易与宿主细胞相互作用。为了研究PPE38是否在分枝杆菌致病中发挥作用,我们利用斑马鱼感染模型,研究PPE38突变株的毒力改变。实验结果表明,感染突变株的斑马鱼生存时间较野生组显著延长。肝脏CFU计数表明突变株在斑马鱼体内的增殖速度低于野生株。组织病理学研究发现,在感染15天后,野生型感染组中出现大范围组织坏死,完整的肉芽肿结构少见,大量海分枝杆菌播散至坏死组织区域,除肝脏外,肠绒毛和腹膜间隙也观察到很多细菌。而突变株感染组在15天时,细菌多局限于完整的肉芽肿结构中,周围组织坏死少见。提示PPE38在体内能够导致组织坏死,从而加速细菌播散,加速斑马鱼死亡。使用突变株感染巨噬细胞发现,突变株对巨噬细胞的侵染能力显著降低。同时,突变株在巨噬细胞内的增殖速度减慢,对巨噬细胞的毒性减低。更进一步的,通过使用突变株或过表达PPE38蛋白的耻垢分枝杆菌侵染巨噬细胞,我们发现,PPE38蛋白能够诱导促炎因子TNF-a和IL-6的表达。本研究表明PPE38蛋白能够调节宿主免疫应答,是分枝杆菌重要的致病因子。（第一章）通过对海分枝杆菌转座子突变库的筛选,我们发现一个突变株的菌落表型显著改变。该突变株的突变位点位于MMAR2340（pks5）和MMAR2341之间。Real-time PCR结果表明,突变造成pks5基因表达下调20倍,而MMAR2341表达无变化。由于pks5在脂质合成中起作用,突变株的细胞壁脂质合成可能发生改变。2D-TLC实验证明,pks5突变株细胞壁脂质成分LOSs合成完全消失,而将pks5基因互补回突变株,其LOSs合成完全回复。LOSs是分枝杆菌重要的脂质成分,对LOSs功能的研究还不深入,有研究表明,纯化的LOSs能够抑制巨噬细胞TNF-α的分泌,提示LOSs可能类似于PGL,是分枝杆菌的毒力脂质[21]。对pks5突变株研究发现,在LOSs缺失后,海分枝杆菌索状结构改变,沉积速率提高,迁移能力减弱。同时,突变株对巨噬细胞的侵染能力下降,但突变株在巨噬细胞内的生长速率与野生型相比没有显著性差异。为了研究LOSs是否在分枝杆菌致病性中发挥作用,我们使用斑马鱼感染模型,观察LOSs突变株是否在斑马鱼体内减毒。实验发现,pks5突变株感染的斑马鱼较野生型菌株感染的斑马鱼生存时间显著延长。肝脏菌载量实验表明,pks5突变株在斑马鱼体内增殖减慢。为了进一步证实LOSs是毒力因子,我们利用另一株LOSs的突变株1271（只合成LOSI）,进行斑马鱼感染实验,同样发现1271在斑马鱼体内减毒,从而证明LOSs是海分枝杆菌重要的毒力脂质。（第二章）分子流行病学是研究结核分枝杆菌传播和种群进化的有力工具。研究表明,不同进化分支上的结核分枝杆菌在不同的国家和地区流行,不同基因型菌株的致病性和传播力不尽相同。例如,一些细胞和动物模型证明在东亚流行的北京基因型菌株相比起其他基因型的菌株具有更高的毒力,能够抑制宿主的免疫反应。本研究根据3R基因（DNA Repair, DNA Recombination, DNA Replication;DNA修复,DNA重组,DNA复制相关基因）的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNP）,构建了上海地区北京基因型菌株的进化树[22]。将北京基因型菌株分为7个亚型（Bmyc2, Bmyc4, Bmyc6, Bmyc10, Bmyc13, Bmyc25和Bmyc26）。各亚型菌株的群体数量差异很大,其中一个新进化出的亚型（Bmyc10）在人群中占有主导地位,大于50%的北京基因型菌株属于该亚群,提示该亚型的菌株在致病性和传播力上可能比其它亚型具有一定优势。为了研究北京基因型不同亚型菌株引起宿主免疫应答的差异,我们使用不同亚型的代表性菌株和非北京型菌株H37Rv,感染巨噬细胞,在不同的时间点收集细胞RNA,用Microarray研究巨噬细胞基因表达水平的差异。结果表明,通过对转录谱结果聚类分析发现,在感染后18小时,H37Rv能够与北京基因型菌株分开,但北京基因型各亚型与成簇无相关性。对感染后的细胞上清中细胞因子进行检测,也未发现各个菌株亚型之间的差异,提示北京基因型各亚型菌株引发的THP-1细胞免疫应答没有显著性差异。对13株分枝杆菌感染巨噬细胞后差异表达的基因进行转录调控分析可以发现,差异表达的大多数基因,受到转录调控因子STATs,Oct-1,IRF-1,IRF-7的调控,提示STATs,Oct-1,IRF-1和IRF-7在抗结核免疫中的关键作用。（第三章）