纳米材料由于具有独特的光学、电化学、催化性能以及良好的生物相容性,已被广泛应用于生物化学和生物医学研究中。在生化分析领域,将纳米材料应用于生物传感器的制备可以显著提高传感器的分析性能。至今,基于纳米材料的生物传感器(纳米生物传感器)已被应用于DNA、蛋白质、多肽等多种生物分子的检测,并在生化分析领域显示了十分诱人的应用前景。尽管如此,相对于传统生物传感技术,纳米生物传感器尚处于起步阶段。在利用纳米材料构建生物传感器的过程中,关键的一步在于如何将纳米材料的优势与生物识别事件相结合。因此,设计和构建灵敏度更高、选择性更好的纳米生物传感器仍是生物传感领域的研究热点。芯片电泳(MCE)是微流控芯片技术的重要组成部分,也是近年来发展最快的分离分析技术之一。与传统分离技术相比,MCE具有操作简单、分离效率高、分析速度快、试剂和样品消耗量少、易于集成化和自动化等优点。正是由于这些独特的优势,MCE已经被(?)泛应用于小分子、DNA和蛋白质等多种物质的分离和检测。相对于传统分离技术如高效液相色谱和气相色谱,MCE技术尚不成熟,而且目前所建立的大多数MCE分析方法无法应用于实际样品特别是生物样品分析。因此,建立高灵敏的MCE分析方法,并应用于生物样品分析,对于推动生物化学和生物医学的发展,具有十分重要的意义。基于以上考虑,本论文利用几种纳米材料如纳米金(AuNPs)、二氧化硅纳米粒子(SiO2NPs)、量子点(QDs)的独特光学性质,发展了几种新型光学生物传感技术；此外,利用MCE技术建立了一系列用于检测复杂生物样品中痕量物质的新方法。具体内容如下：1.基于功能化纳米材料的生物检测新体系研究(1)基于AuNPs能够增强荧光偏振的原理,以EcoRI酶为模型分析物,发展了一种简单、超灵敏检测核酸内切酶的荧光偏振生物传感器。首先在纳米金表面修饰具有捕获功能的DNA,再与荧光标记的部分互补DNA杂交,形成具有EcoRI酶识别位点的双链DNA功能化纳米探针。当EcoRI酶存在时,纳米探针表面的双链DNA被EcoRI酶选择性切断,释放出更短的荧光标记的DNA片段,从而导致荧光偏振值(P)减小。根据P值的变化可以定量分析EcoRI酶的活性。此传感器不仅具有较宽的检测范围和很低的检测限,而且选择性很高。此外,它还可以用于核酸内切酶抑制剂的筛选。(2)基于核酸适体构型转换触发纳米粒子信号放大的原理,利用三磷酸腺苷(ATP)作为模型分析物,构建了一种检测生物分子的荧光偏振适体传感器。该传感体系以荧光标记的发夹式核酸适体作为分子识别探针和检测探针,单链DNA修饰的SiO2NPs作为信号放大探针。当没有目标分子存在时,荧光标记的发夹式核酸适体不会与纳米粒子功能化的DNA结合,此时体系的P值很小。当加入ATP后,它与核酸适体结合使发夹式结构打开,且打开的发夹式核酸适体能与纳米粒子功能化的DNA杂交,从而导致体系的P值增大。据此可用于定量检测ATP,检测范围为40pmol/L～100μmol/L。该方法不需要复杂的分离、洗涤步骤,整个过程都在均相中完成。通过改变适体的碱基序列,该方法很容易用于蛋白质、金属离子及其它小分子物质的分析。(3)基于DNA切割反应的特异性和AuNPs的超高荧光猝灭能力,以EcoRⅠ酶、EcoRⅤ酶和HaeⅢ酶为模型分析物,构建了一种能同时高灵敏检测多种核酸内切酶的多色纳米分子信标。在该体系中,三种标记了不同荧光染料的发夹式DNA(酶底物)通过金-硫的亲和作用共同组装在AuNPs表面形成多色纳米分子信标。由于自组装作用拉近了AuNPs与荧光染料的距离,因此所有荧光染料的荧光通过纳米表面能量转移被猝灭。当目标核酸内切酶存在时,它们能选择性切断发夹式DNA,释放出游离的荧光标记DNA片段,从而导致相应荧光染料的荧光恢复。据此可以实现多种核酸内切酶活性的同时检测。所建立的方法具有检测范围宽、灵敏度高和选择性好等优点。此外,基于核酸内切酶抑制剂对DNA切割反应的抑制作用,该方法还可以用于核酸内切酶抑制剂的筛选。(4)利用QDs的独特光学性质,结合分子间及分子内猝灭剂的高效荧光猝灭能力,构建了一种新型纳米探针用于核酸内切酶检测及抑制剂筛选。在该探针中,荧光猝灭剂通过与酶底物DNA片段的直接标记和互补DNA杂交方式连接到QDs表面。在没有核酸内切酶存在时,QDs的荧光通过能量转移被猝灭,纳米探针处于“关闭”状态。当体系中存在目标核酸内切酶时,QDs表面的双链DNA被切断,猝灭剂脱离QDs表面而使QDs的荧光恢复。QDs的荧光增强幅度与核酸内切酶含量有关,据此可以用于核酸内切酶活性的分析。采用不同发射波长的QDs和对应的猝灭剂,该方法可以实现多种核酸内切酶的同时检测。此外,基于核酸内切酶抑制剂能够抑制酶切反应,该方法还可以用于核酸内切酶抑制剂的筛选。2.基于芯片电泳的生物检测新方法研究(1)以荧光素异硫氰(酸酯(FITC)为柱前衍生试剂,采用自制的玻璃/聚二甲基硅氧烷(PDMS)复合芯片,结合芯片电泳激光诱导荧光(MCE-LIF)检测技术,建立了一种简单、快速、灵敏检测生物样品中D-酪氨酸的新方法。该方法以γ-环糊精为手性选择剂,结合胶束电动色谱分离模式,通过优化分离条件,在150s内实现了D/L-酪氨酸对映体的快速分离,D-酪氨酸的检测限达到了33nmol/L。利用该方法对正常人与肾衰竭病人血浆中D-酪氨酸的含量进行了测定,结果显示肾衰竭病人血浆中D-酪氨酸的含量明显高于正常人。该方法可用于肾衰竭病疾病的临床诊断。(2)采用集成柱前微反应器和柱后微反应器的玻璃/PDMS复合芯片,提出了一种在线衍生-MCE-化学发光(CL)检测新技术,并将其应用于巯基类化合物的测定。该方法将衍生反应、进样、电泳分离和CL检测集成在同一片芯片中进行,实现了高度的集成化和自动化。以N-(4-氨基丁基)-N-乙基-异鲁米诺(ABEI)和邻苯二醛(OPA)为在线衍生试剂,卡托普利、硫普罗宁、硫鸟嘌呤和6-巯基嘌呤等四种巯基类药物为模型分析物,采用胶束电动色谱分离模式,在80s内完成了四种药物的分离和同时检测。该方法具有很高的灵敏度,四种巯基类药物的检测限在8.9-13.5nmol/L范围。利用该方法对人血浆样品中巯基类药物的含量进行了测定。(3)采用MCE-LIF或CL检测技术,建立了快速检测生物样品中痕量物质的免疫分析新方法。该方法采用竞争免疫模式,以荧光或CL标记的抗原为示踪剂,与游离抗原(分析物)竞争结合有限量的抗体,免疫反应后进行电泳分离检测。利用听建立的方法分别对人血浆中苯巴比妥(PB)和人血清中睾酮(T)的含量进行了测定。与常规免疫分析方法相比,该方法具有简单、快速、灵敏度高、成本低等优点。(4)采用玻璃微珠作为抗体固定介质,结合MCE-LIF检测技术,发展了一种多元免疫分析方法。该方法将表面固定有不同抗体的多种玻璃微珠、多种荧光标记的抗原和游离抗原(分析物)同时置于芯片的样品池中进行免疫反应,然后进样、分离和检测。由于玻璃微珠的引入,免疫复合物不能进入分离通道,从而使分离变得更简单。此外该方法只需单一检测器和单一荧光标记试剂即可完成多种物质的同时免疫检测,降低了分析成本。以PB、苯妥英(PHT)、卡马西平(CBZ)和茶碱(Th)为模型分析物,使用该方法能够在20min内完成四种物质的同时测定,检测限在1.8-2.5nmol/L范围内。通过更换不同的抗原/抗体对,该方法很容易应用到其它物质如蛋白质、多肽及环境污染物的分析。