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原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,发病率位居所有恶性肿瘤的第五位。2012年全世界肝癌新发病例数为78万,中国约占全球人数的一半。我国肝癌发病男性明显多于女性,提示男性在危险因素暴露机会或者对危险因素的易感程度方面高于女性。因此,寻找男性肝癌发生发展过程中发挥重要作用的蛋白分子和干预靶分子,已经成为当前肝癌研究的热点。Y染色体基因编码的睾丸特异性蛋白1(Testis-specific proteinY-encoded 1,TSPY1)是 TSPY/TSPY-L/SET/NAP-1 (TTSN)蛋白超家族成员之一,具有高度保守的SET/NAP结构域。TSPY1可与多种转录因子相互结合发挥作用,主要参与基因表达调控、染色质重塑、蛋白质合成翻译和细胞周期进程等重要细胞生命活动。已有研究证实,TSPY1在性腺母细胞瘤、睾丸生殖细胞肿瘤以及前列腺癌的上皮细胞中异常高表达,提示TSPY1可能在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。本课题组前期研究采用iTRAQ与质谱相结合的定量蛋白质组学技术,Realtime-PCR和Western Blot技术,在肝癌组织中成功筛选并鉴定出与男性肝癌高发相关的TSPY1差异蛋白。在此基础之上,本研究拟采用Realtime-PCR和Western Blot技术,分析TSPY1在Y染色体阳性肝癌细胞中基因和蛋白的表达水平;采用慢病毒载体转染和RNA干扰等技术,观察靶向沉默TSPY1基因后肝癌细胞株MHCC97-H增殖和侵袭转移等生物学行为的变化;进一步选取HIF-1α侵袭因子为研究对象,探讨TSPY1是否通过调节HIF-1α的表达影响肝癌细胞的侵袭能力,为探索以TSPY1为靶点的男性肝癌防治提供新思路。第一部分TSPY1在Y染色体阳性肝癌细胞中的表达分析人类TSPY1主要分布于胚胎睾丸和成人睾丸的精原细胞、精母细胞以及部分精子细胞中。我们的前期研究发现,TSPY1在男性肝癌组织中特异性高表达,提示TSPY1可能与男性肝癌的发生发展密切相关。本部分采用Realtime-PCR和Western Blot技术,分别检测SMMC-7721,HuH-7,Hep G2,MHCC97-L,MHCC97-H,HCCLM3 等六种不同转移潜能的 Y染色体阳性肝癌细胞TSPY1 mRNA和蛋白相对表达水平。Realtime-PCR以β-actin为内参基因,采用2-△△Ct法计算肝癌细胞TSPY1基因的mRNA相对表达水平;Western Blot以GAPDH作为内参对照,采用Bio-rad Quantity One软件分析,计算目的蛋白的相对表达量。Realtime-PCR结果显示,TSPY1基因在高转移潜能的MHCC97-H和HCCLM3肝癌细胞株中mRNA水平升高,而在低转移潜能或不转移的SMMC-7721和Hep G2肝癌细胞株中mRNA水平降低。Western Blot检测结果与Realtime-PCR检测结果基本一致。研究结果表明,TSPY1表达水平与Y染色体阳性肝癌细胞株的转移潜能密切相关,TSPY1可能在肝癌细胞增殖、侵袭转移等恶性生物学行为中发挥重要作用。第二部分TSPY1对肝癌细胞株MHCC97-H生物学功能的作用研究TSPY1基因编码的蛋白属于TSPY/TSPY-L/SET/NAP-1 (TTSN)蛋白超家族。TSPY1可与多种转录因子相互结合,通过影响基因表达调控、核小体装配、染色质重塑、蛋白质合成翻译和细胞周期进程等重要细胞生命活动,从而参与肿瘤的发生发展。本部分研究我们通过RNA干扰技术建立TSPY1沉默肝癌细胞株MHCC97-H,采用Realtime-PCR和Western Blot技术检测TSPY1沉默肝癌细胞株MHCC97-H TSPY1 mRNA和蛋白相对表达水平,并采用CCK8细胞增殖实验和Transwell小室侵袭实验,观察TSPY1表达下调后肝癌细胞株MHCC97-H增殖和侵袭能力的变化。研究结果显示,TSPY1-ShRNA慢病毒载体转染后,肝癌细胞株MHCC97-H TSPY1 mRNA和蛋白相对表达水平显著下调,表明TSPY1沉默肝癌细胞株MHCC97-H构建成功;CCK8细胞增殖实验结果显示,TSPY1沉默肝癌细胞MHCC97-H增殖能力明显低于对照组细胞;Transwell小室侵袭实验结果显示,TSPY1沉默肝癌细胞MHCC97-H穿过小室基底膜的数量明显低于对照组细胞。研究结果表明,我们成功构建了 TSPY1沉默肝癌细胞株MHCC97-H,沉默TSPY1表达可以显著抑制肝癌细胞的增殖和侵袭迁移能力。第三部分TSPY1对HIF-1a表达的调控作用研究侵袭和转移是导致原发性肝癌患者预后不良的主要因素,但其中的分子机制尚未完全阐明。研究证实缺氧微环境可增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力,并且在肿瘤增殖、血管形成以及肿瘤耐药等方面发挥重要作用。缺氧诱导因子-1 (hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是在缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种核转录因子,是调节细胞适应缺氧微环境的关键因子。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位组成,其中HIF-1α是特异性的氧调节亚基。本部分研究我们建立在TSPY1沉默肝癌细胞株MHCC97-H的基础上,采用Realtime-PCR和Western Blot技术检测TSPY1沉默肝癌细胞MHCC97-H HIF-1α mRNA和蛋白相对表达水平。结果显示,TSPY1沉默肝癌细胞MHCC97-H HIF-1α mRNA和蛋白相对表达水平明显低于对照组,表明TSPY1可能通过调控HIF-1α表达促进男性肝癌的侵袭转移。结论1. TSPY1表达水平与Y染色体阳性肝癌细胞株的转移潜能密切相关。2.成功构建TSPY1沉默肝癌细胞株MHCC97-H,沉默TSPY1表达可以显著抑制肝癌细胞的增殖和侵袭转移能力。3. TSPY1可能通过调控HIF-1α表达影响男性肝癌的侵袭转移,TSPY1可能是男性肝癌的一个潜在预防和治疗靶点。