血管贯穿各组织器官,行使运输和调节功能。它的基本结构包括内膜、中膜和外膜三部分,分别由内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞以及结缔组织组成。其中血管内皮细胞不仅接受血液活性物质的调控,也对血管平滑肌细胞具有重要的调节作用。因此血管内皮细胞功能异常对血管的调节和功能维持具有重要的作用。大量证据表明,血管内皮细胞衰老与多种心脑血管疾病(高血压、冠心病、脑卒中等)密切相关,但内皮细胞衰老的机制并不清楚。micro RNA是一类可以与m RNA 3’UTR区域结合进而降低蛋白质翻译效率的表观遗传学调控模式,已有研究表明micro RNA与血管内皮细胞衰老密切相关。实验室前期结果发现micro RNA-33a随增龄而在血管中表达增加,后来有报道发现它可以促进血管动脉粥样硬化的发生。但micro RNA-33a是否通过促进血管内皮细胞衰老从而导致动脉粥样硬化的发生尚未报道。本研究以人脐静脉内皮细胞作为模型,阐明micro RNA-33a对内皮细胞衰老的作用和机制。研究内容包括以下几个方面:1.过表达hsa-mi R-33a-5p(mi R-33a-5p)导致SA-β-gal阳性细胞比例增加(约4倍),细胞增殖能力下降(增殖细胞减少0.62倍);通过流式细胞仪分析发现细胞周期明显阻滞于G2/M期。说明mi R-33a-5p能够促进内皮细胞衰老。2.为阐明mi R-33a-5p诱导内皮细胞衰老的机制,我们运用mi RWalk等预测工具(限定条件为最小种子序列长度7,p<0.05),结合micro RNA“不改变或者降低靶基因m RNA水平”的作用特点,运用人脐静脉内皮细胞衰老转录组学的三个数据库(细胞复制性衰老及DOX、MMC诱导衰老),初步筛选出9个mi R-33a-5p可能调节的靶基因。3.为了验证这些初步预测的基因是mi R-33a-5p真正的靶基因,我们将该9个靶基因的结合序列分别构建于双荧光素酶报告基因的质粒中,发现mi R-33a-5p能显著降低ABCA1、BTBD2和ARID5B的表达;如果将这些序列上mi R-33a-5p结合位点突变,则发现ABCA1、BTBD2和ARID5B荧光素酶活性不再受mi R-33a-5p调节。表明mi R-33a-5p通过与靶基因特异性结合抑制ABCA1、BTBD2和ARID5B的表达。4.为了验证mi R-33a-5p是通过哪个靶基因促进内皮细胞的衰老,我们分别在内皮细胞中敲低ABCA1、BTBD2和ARID5B,发现敲低BTBD2基因能够显著抑制细胞增殖,促进内皮细胞衰老;而ABCA1和ARID5B基因敲除组与对照组的细胞无显著差异。根据以上研究内容,本研究首次发现mi R-33a-5p可以诱导内皮细胞衰老,并鉴定ABCA1、BTBD2和ARID5B是其下游靶基因;同样首次验证了BTBD2也可以促进内皮细胞衰老,确定mi R-33a-5p可能通过调控靶基因BTBD2的表达而促进内皮细胞衰老这一新的信号通路轴。本研究为理解内皮细胞衰老的表观遗传学调控机制提供了依据,为通过关于内皮细胞衰老来控制老年心脑血管疾病的发生发展提供了新的可干预靶点。