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结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis) H37Rv 菌株基因组测序工作的完成为加深理解这种病原菌的生物学特性以及研发新的抗结核药物提供了基础。H37Rv 菌株的基因组大小为 4411529 bp,约含 4000 个基因,其中 700 个基因与细胞壁的代谢有关,但部分基因的功能尚未确定。结核分枝杆菌细胞壁是细菌特有的、赖以生存的结构基础。其核心结构由最内层的肽聚糖 (Peptidoglycan, PG)、中间层的聚阿拉伯糖半乳糖 (Aribinangalactan, AG) 以及最外层的分枝菌酸 (Mycolic acid) 所构成。聚阿拉伯糖半乳糖为连接肽聚糖和分枝菌酸、维持细胞壁结构完整性的重要组分,所以可作为研发新一代抗结核药物的理想靶标。因此,有必要深入研究聚阿拉伯糖半乳糖结构及其合成与分解代谢规律。1996年,辛毅博士首次在耻垢分枝杆菌 (Mycobacterium smegmatics) 中发现了一种内源性的能降解AG的聚阿拉伯糖水解酶,并在2001年完成了此酶的初步纯化及酶蛋白的N-末端氨基酸序列 (MPAPAVPQSVITEAVGLA-) 测定。将N-末端氨基酸序列与耻垢分枝杆菌基因组数据库进行BLAST分析,得到编码耻垢分枝杆菌聚阿拉伯糖水解酶的基因ara及聚阿拉伯糖水解酶的氨基酸序列。无致病性的耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌同属分枝杆菌,二者具有相似的细胞壁结构。将耻垢分枝杆菌聚阿拉伯糖水解酶的氨基酸序列与结核分枝杆菌基因组数据库进行BLAST分析,在结核分枝杆菌中有两种未知功能的蛋白质Rv2032和Rv3127与耻垢分枝杆菌聚阿拉伯糖水解酶分别有50% 和39% 同源性。本论文的目的是 (1) 从结核分枝杆菌中分别克隆Rv2032和Rv3127基因;(2)构建以大肠杆菌为宿主的表达质粒pET16b-Rv2032 和<WP=5>pET16b-Rv3127和以分枝杆菌为宿主的表达质粒 pVV2-Rv2032和pVV2-Rv3127;(3) 分别在大肠杆菌BL21(DE3) 和耻垢分枝杆菌 M.semgmatics mc2155菌株中表达目标蛋白以筛选高表达工程菌株;(4) 鉴定Rv2032和Rv3127蛋白质的功能。本论文所获得的结果如下:1.扩增Rv2032和Rv3127基因从结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组数据库 (http://genolist. pasteur.fr/TubercuList/)中获得Rv2032和Rv3127 基因的核苷酸序列。根据核苷酸序列设计PCR引物,并在每一基因的上、下游引物中分别引入了NdeI和BamHI限制性内切酶位点。利用LA Taq DNA聚合酶成功地从H37Rv菌株基因组DNA中扩增了Rv2032和Rv3127基因,在Rv2032和Rv3127基因的PCR产物的两端分别携带NdeI和BamHI位点。2.克隆Rv2032和Rv3127基因和测定DNA序列将上述PCR产物连接到克隆载体pMD18-T的EcoRV位点,将连接产物转化到大肠杆菌DH5( 菌株的感受态细胞中。用限制性内切酶酶切方法筛选出阳性重组质粒pMD18-Rv2032(#3) 和pMD18-Rv3127(#3)。对Rv2032 和Rv3127基因进行DNA序列测定,测序结果与结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组数据库中的Rv2032 和Rv3127基因序列完全一致,表明用PCR技术扩增的Rv2032 和Rv3127基因不存在任何碱基突变。3.构建表达质粒用NdeI和BamHI双酶切阳性重组克隆质粒pMD18-Rv2032(#3) 和pMD18-Rv3127(#3),纯化Rv2032 和Rv3127基因,将Rv2032 和Rv3127基因分别连接到用于大肠杆菌的表达载体pET16b及用于分枝杆菌的表达载体pVV2的NdeI和BamHI位点。将连接产物转化到大肠杆菌NovaBlue 菌株的感受态细胞中,用限制性内切酶酶切方法和PCR方法筛选出阳性重组表达质粒pET16b-Rv2032(#1) 和pET16b-Rv3127(#1) 以及pVV2-Rv2032(#2) 和 pVV2-Rv3127(#2)。每一重组表达质粒中的目的基因产物的N端与表达质粒上的多聚组氨酸 (His10) 标记形成融合蛋白,便于目的蛋白的检测和纯化。4.Rv2032和Rv3127目的蛋白的表达1) 目的蛋白在大肠杆菌中的表达(1) 将表达质粒pET16b-Rv2032(#1) 和pET16b-Rv3127(#1) 分别转化到大肠杆菌BL21(DE3) 宿主细胞中。(2) 在诱导温度为25(C,用0.4 mM IPTG诱导物诱导pET16b- <WP=6>Rv2032(#1)/ BL21(DE3) 和pET16b-Rv3127(#1)/BL21(DE3) 16小时,获得一定量的可溶性目的蛋白。(3) 用超声波破碎诱导的大肠杆菌,离心后取上清液。用Ni-NTA亲和层析方法纯化Rv2032和Rv3127目的蛋白,经SDS-PAGE电泳后,将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上,用抗多聚组氨酸抗体及偶联碱性磷酸酶的二抗检测到表达的Rv2032和Rv3127目的蛋白。2) 目的蛋白在分枝杆菌中的表达将重组表达质粒pVV2-Rv2032(#2) 和pVV2-Rv3127(#2) 电转化到耻垢分枝杆菌mc2155菌株中,在37(C条件下表达目的蛋白。用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况。5.聚阿拉伯糖水解酶活性的测定将分枝杆菌的聚阿拉伯糖半乳糖(AG) 作为底物与含目的蛋白的细胞上清液(即粗酶) 进行酶促反应,用Bio-Gel P10凝胶过滤层析方法分离反应产物。通过比较酶促反应前、后AG分子量的变化来鉴定目的蛋白的聚阿拉伯糖水解酶的活性。初步结果表明,表达的目的蛋白无明显的聚阿拉伯糖水解酶活性。本课题利用分子克隆技术克隆了Rv2032和Rv3127基因,利用大肠杆菌表达了Rv2032和Rv3127目的蛋白。这一工作的完成为进一步用纯化的酶来优化酶促反应条件、研究酶促反应动力学特性提供了物质基础。