【摘 要】
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谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase,GDH）是维持生物体碳氮代谢平衡的一类重要的酶。在植物、动物、微生物中都广泛存在的GDH根据辅因子的分类可分为三种,NADPH-GDH型、NADH-GDH型和NADPH/NADH型。在水稻中通过基因工程引入异源表达低等生物的GDH,可以获得在缺氮土壤中正常生长的稳定株系,但是转基因水稻在食物安全性方面存在争议。水稻表达的四种GDH中,O
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谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase,GDH）是维持生物体碳氮代谢平衡的一类重要的酶。在植物、动物、微生物中都广泛存在的GDH根据辅因子的分类可分为三种,NADPH-GDH型、NADH-GDH型和NADPH/NADH型。在水稻中通过基因工程引入异源表达低等生物的GDH,可以获得在缺氮土壤中正常生长的稳定株系,但是转基因水稻在食物安全性方面存在争议。水稻表达的四种GDH中,OsGDH4与固氮能力相关并和真菌表达的GDH同属于NADPH-GDH型,但其固氮能力和真菌表达的GDH相比较弱。本研究拟从蛋白质分子结构层面上研究OsGDH4的固氮机理,旨在改造并提升水稻内源OsGDH4的固氮能力。我们基于已知的Aspergillus niger GDH晶体结构5XVX,利用Modeller软件对未知结构的真菌GDH和水稻OsGDH4进行同源建模,得到了9个真菌GDH以及水稻OsGDH4的单体结构。并对建模获得的GDH结构与配体分子AKG以及辅因子NADPH的复合体进行了2 ns的分子动力学模拟并计算MM/PBSA结合能。分别分析GDH与AKG和NADPH的结合能与其酶活性相关的氨根离子的Km值的相关性。分析发现GDH与AKG和NADPH的结合能与Km值呈现正向相关性。我们通过对水稻OsGDH4和真菌GDH结构的对比和观察,发现其活性中心的两个关键氨基酸存在差异。设计了两个单突变体和一个双突变体,通过酶活性实验测定OsGDH4突变前后的酶活性。设计出了氨基酸点突变引物序列和Eco RI酶切位点以及Kpn I酶切位点。经过原核表达获得经过突变后的OsGDH4单突变体蛋白和双突变体蛋白。设计酶活实验分别测定单突变体、双突变体、未突变的OsGDH4的酶活性。本研究用结构生物学和计算生物学的方法鉴定了引起水稻与真菌GDH差异的氨基酸。从分子生物学的角度设计了水稻OsGDH4酶活测定实验。这为从氨基酸突变角度改良水稻OsGDH4的固氮能力提供了实验基础。也为提高水稻固氮能力的研究方法提供了新的思路。
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