论文部分内容阅读
发酵过程的微生物、微生物产生的蛋白以及化学成分变化是普洱茶独特品质形成的关键因素。为进一步研究普洱茶独特品质形成的关键因素,本论文从云南德凤茶厂收集了2个批次36个普洱茶发酵样品(分别标注为B与M),开展了以下5方面研究:(1)应用基于Illumina Mi Seq测序的宏基因组学技术研究发酵样品微生物群落结构与动态变化;(2)应用基于LC-MS/MS的宏蛋白组学技术研究发酵样品微生物蛋白;(3)应用紫外分光光度法、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)研究发酵样品化学成分;(4)通过单一优势菌发酵以及蛋白检测,验证微生物在普洱茶发酵种产生的蛋白;(5)通过KEGG数据库检索蛋白功能,筛选与普洱茶品质形成相关的酶。主要研究结果如下:(1)普洱茶发酵样品微生物群落结构与动态变化研究通过对发酵样品微生物DNA的提取,细菌16S rRNA基因V4-V5区、真菌18S rRNA基因ITS区的扩增、Illumina Mi Seq高通量测序与生物信息学分析,发现发酵原料与初期的优势细菌是肠杆菌(Enterobacteriaceae),发酵后期优势细菌是芽孢杆菌(Bacillaceae)。发酵原料与初期的优势真菌是曲霉(Aspergillus),发酵中期蓝状菌(Rasamsonia)和嗜热丝孢菌(Thermomyces)繁殖,与曲霉属真菌共同成为优势菌,但出堆样品的优势菌均是曲霉。(2)普洱茶发酵样品微生物蛋白研究采用Tris酚抽法、胰蛋白酶酶解、LC-MS/MS分析、Proteome Discoverer 1.4软件搜索SwissProt的微生物蛋白数据库的宏蛋白组学技术,分别从发酵样品中检测到27-379个细菌蛋白和189-1893个真菌蛋白。检测的细菌蛋白主要由变形菌门(Proteobacteria)的细菌产生,真菌蛋白主要由曲霉属真菌产生。检测蛋白的主要分子功能是催化活性(catalytic activity),主要定位于细胞质(cytoplasm),主要参与代谢过程(metabolic process)。(3)普洱茶发酵样品化学成分研究运用紫外分光光度法和HPLC法测定发现从1翻开始水浸出物、茶多酚、儿茶素总量、游离氨基酸含量下降(P<0.05)。感官审评发现随着发酵进行,茶汤滋味变得醇和,汤色红褐,香气陈香,叶底红褐。(4)优势真菌在茶叶基质上产生的蛋白研究分别将黑曲霉(Aspergillus niger)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和Blastobotrys adeninivorans共4种普洱茶发酵样品分离的优势真菌接入液体(茶汤)和固体茶叶培养基发酵,经LC-MS/MS分析,液体发酵鉴定到16-1916个的蛋白,固体发酵鉴定到493-1632个蛋白,表明了上述微生物可以在普洱茶发酵中产生多种蛋白。经分析发现这些蛋白主要的分子功能为催化活性,主要定位于细胞质,主要参与代谢过程。(5)与普洱茶品质形成相关的酶通过KEGG数据库检索,发现了98个与普洱茶品质形成相关的酶。包括Alpha-木糖苷酶(Alpha-xylosidase)、Beta-葡萄糖苷酶(Beta-glucosidase)、果胶裂解酶(Pectin lyase)等参与多糖降解的酶;儿茶酚1,2-双加氧酶(Catechol 1,2-dioxygenase)、苯酚2-单加氧酶(Phenol2-monooxygenase)等与酚类代谢有关的酶;腺苷酸基琥珀酸合成酶(Adenylosuccinate synthetase)、腺苷酰琥珀酸裂解酶(Adenylosuccinatelyase)等与嘌呤碱代谢有关的酶。这些酶催化的化学反应以及其在普洱茶独特品质形成中的作用是今后研究的重点。综上,本论文应用宏基因组学和宏蛋白组学技术,阐明了所研究普洱茶发酵样品微生物群落与蛋白,并且发现了参与多糖降解、酚类和咖啡碱代谢等可能与普洱茶品质形成相关的酶,为研究微生物在普洱茶发酵中的作用提供了新的理论知识和重要线索。