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引言急性呼吸道感染(acute rispiratory infections,ARIs)的发病率在我国小儿各类疾病中占首位,是儿科的常见病、多发病。目前,已经证实,儿童急性呼吸道感染中80%以上是病毒感染引起的。可引起呼吸道感染的病毒种类很多,至少有7个病毒科的10多类、共239个型别的病毒。包括鼻病毒(rhinovirus,RHV)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、人偏肺病毒(human metapneumovirus,MPV)、A 型流感病毒(influenza virus type A,IF A)、B 型流感病毒(Iinfluenza virus type B,IFB)、肠道病毒(enterovirus,EV)、副流感病毒 1-3 型(parainflenza virus type 1-3,PIV1-3)、博卡病毒(bocavirus,BoV)、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)、EB 病毒(epstein-barr virus,EB)、麻疹病毒(measles virus,MV)、腺病毒(adenovirus,ADV)、冠状病毒(coronaviruses,CoV)NL63/229E/OC43/SARS 等。呼吸道病毒传染性强,可以引起局部爆发和世界大范围流行,严重影响人类健康。而且同一种病毒可以引起多种的临床症状,不同的病毒也可引起同一种临床症状。因此,病原学证据在临床诊治和流行病监控中显得尤为重要。目前的检测方法,如病毒分离培养、病毒血清学检测等方法,已经无法满足临床上高效、快速和高通量的要求。目的建立一种可同时检测18项小儿常见呼吸道感染病毒的快速检测方法,并开发试剂盒。方法从呼吸道感染如普通感冒、儿童中耳炎、咽炎、肺炎、毛细支气管炎、支气管炎、哮喘等患者或疑似患者的咽拭子或痰液样本中,经磁珠抽提后提取呼吸道病毒的核酸DNA/RNA。使用所得的病毒核酸,建立逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)结合Taqman探针荧光定量PCR的检测方法。针对18项小儿常见呼吸道感染病毒,包括鼻病毒(RHV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(MPV)、A型流感病毒(IFA)、B型流感病毒(IFB)、肠道病毒(EV)、副流感病毒1-3型(PIV1-3)、博卡病毒(BoV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EB)、麻疹病毒(MV)、腺病毒(ADV)、冠状病毒(CoV)NL63/229E/OC43/SARS等设计引物和Taqman探针。通过测定RT-PCR的Buffer中不同浓度的 Tris、K+、NH4+、Mg2+、BSA、甘油、Tween-20 和 TritonX-100时各样本的扩增曲线,来选择Buffer中各种离子的浓度。在混合样本中,分别加入不同浓度Taq酶、不同浓度的逆转录酶、不同浓度的引物和探针,其他实验条件相同,进行病毒核酸的扩增,检测其扩增曲线,从而选择Taq酶、逆转录酶、引物和探针的合适浓度。将得到的病毒核酸应用于一次多重实时荧光定量PCR反应中,以达到同时检测多种荧光信号的目的。并与所得的PCR产物纯化后直接测序或TA克隆进行测序得到的基因测序结果进行对比。在湖州市中心医院取100例呼吸道病毒患者和100例健康人群的痰液和咽拭子标本来评价和验证所建立方法在临床应用中的特异性和灵敏度。结果通过比较市面上已有的成熟磁珠抽提试剂盒,选取天隆科技生物有限公司的核酸提取试剂盒作为本方法可配套使用的核酸抽提试剂盒。根据不同浓度质控品扩增结果,根据拷贝数的计算方法,计算得到的浓度将其稀释,得到各个稀释浓度的Ct值,选取Ct位于16-23的质控品RNA的作为强阳性质控,Ct位于28-35之间的作为弱阳性质控。分别测定RT-PCR的Buffer中不同浓度的Tris、K+、NH4+、Mg2+、BSA、甘油、Tween-20和TritonX-100时各样本的扩增曲线,根据结果选择 1 OmM Tris,55 mM K+、18mM NH4+ 和 6mM Mg2+、0.17mg/mL BSA、5%甘油和0.1%Tween20作为Buffer的最终组成成分。在混合样本中,加入不同浓度Taq酶,其他实验条件相同,进行病毒核酸的扩增,检测其扩增曲线,最终选择2.5U Taq为最终酶浓度。在混合样本中,加入不同浓度的逆转录酶,其他实验条件相同,进行病毒核酸的扩增,检测其扩增曲线,从而选择浓度1的逆转录酶作为试剂盒逆转录酶的用量。在混合样本中,加入不同浓度的引物和探针,其他实验条件相同,进行病毒核酸的扩增,检测其扩增曲线,结合荧光值和Ct值等,选择合适的引物和探针的浓度。将得到的PCR产物纯化后直接测序或TA克隆进行测序,核对序列,与NCBI数据库进行blast比对,证实该基因序列属于保守区,且高度特异性,与其它细菌、病毒等病原体无交叉反应,可排除假阳性。将各样本浓度稀释至1000 copies/mL左右,对此浓度的样本进行10次重复检测,能够100%检出;当样本浓度过低时(Ct>34左右),10次PCR重复检验不能100%检出阳性。与感染部位相同或者感染症状相似的其他病原体,如水痘带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、链球菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌)无交叉反应。当常见干扰物质如血液、脓液、肺炎治疗用药阿莫西林、罗红霉素和阿奇霉素在检验样本中浓度分别是10%、5%、0.2g/L、0.03g/L和0.15g/L时,不会影响到对样本检测结果的判断。将试剂盒反复冻融6次后,进行检测的结果与未经过冻融的试剂检测结果之间没有显著差异。湖州市中心医院使用三批本研究开发、江苏默乐科技有限公司生产的呼吸道18项病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)对100例呼吸道病毒患者和100例健康人群的痰液和咽拭子标本进行核酸检测,同时与基因测序结果进行对比,得出:试剂盒灵敏度97.98%,特异性98.1%,与测序金标准相比,准确性达到98.04%,批间变异系数<15%。结论1、本研究建立了逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)结合Taqman探针荧光定量PCR的方法,可快速、灵敏、特异地检测18项呼吸道病毒的核酸。2、呼吸道18项病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)已经找到合作厂家,并已经与广州市妇幼儿童医疗中心、南京医科大学附属南京市儿童医院、浙江大学医学院附属儿童医院签订临床试验合同,临床试验正在进行中。