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第一章自噬在强直性脊柱炎外周关节异位骨化作用机制研究目的:1.与腘窝囊肿(popliteal cyst,PC)滑膜组织及细胞比较,自噬标志物LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin1、P62在强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)外周病变关节滑膜组织、滑膜成纤维细胞(synovium fibroblast,SF)中是否升高;2.调节AS外周病变关节SF的自噬水平后其成骨功能是否改变。方法:1.实验设计与分组滑膜组织分组为:AS病变关节、PC。SF分组为:PC、AS病变关节、与自噬调节剂共培养的AS病变关节。检测不同组的成骨标志物碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)及 LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin1、P62 蛋白。2.实验内容2.1免疫组化检测滑膜组织中ALP、LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin1、P62。2.2胶原酶消化法提取SF。2.3流式细胞技术检测CD55、CD90、CD14,明确SF纯度。2.4 MTT检测各组的SF增殖能力及自噬调节剂对其的毒性检测。2.5自噬调节剂调节AS病变关节的SF自噬水平,蛋白印迹技术(western blotting,WB)检测各组细胞的 ALP、LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin1、P62。3.统计分析将实验数据采用SPSS 20.0软件,单因素方差分析进行检验。P<0.05为有统计学意义。结果:1.AS滑膜组织ALP、LC3、Beclin1较PC滑膜组织明显升高,有统计学差异;P62表达情况相反,但没有统计学差异。2.AS、PC滑膜细胞中的SF比率无明显统计学差异,且都占95%以上。3.AS病变关节SF增殖能力最强,加用3-甲基腺嘌共培养的AS的SF增殖能力其次,PC的SF增殖能力最低,三者增殖能力之间存在显著性差异。7mmol/l的3-甲基腺嘌呤对AS的SF无明显细胞毒性的最大浓度。4.AS 的 SF 所表达的 ALP、LC3Ⅱ、Beclin1、LC3Ⅱ 与 LC3Ⅰ 的比值与 PC 的 SF所表达的量存在显著性差异,前者高于后者;运用3-甲基腺嘌呤共培养的AS的SF与未使用3-甲基腺嘌呤共培养的AS的SF所表达的自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1、LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值及ALP之间也存在显著性差异,前者低于后者,且使用3-甲基腺嘌呤共培养的AS的SF随着共培养时间延长自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1、LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值及ALP呈下降趋势,且组间存在显著性差异;P62表达量虽然随着自噬抑制剂使用时间延长在AS的SF内表达量升高,但在各组之间未发现显著性差异。结论:1.AS病变关节滑膜中及SF中自噬水平升高。2.自噬可以正向调节AS病变关节异位骨化。第二章自噬与与股骨头坏死滑膜病变的研究目的:检测股骨头坏死(osteonecrosis of femoral head,ONFH)髋关节滑膜及PC滑膜中LC3、Beclin1、P62蛋白,以明确其滑膜病变是否与自噬存在相关性。方法:取ONFH(无明确病因,ARCO Ⅲ期及其以上病变)髋关节滑膜与膝关节相通的PC滑膜各11例,采用免疫组化检测其中的LC3、Beclin1、P62蛋白。结果:ONFH滑膜、PC滑膜中LC3、Beclin-1弱阳性表达,前者表达量高于后者,但无统计学差异;p62几乎均无表达。结论:ARCO Ⅲ期及其以上ONFH的髋关节滑膜病变与自噬之间不存在相关性。