论文部分内容阅读
背景: 炎症反应是机体对抗外来入侵物质的一种反应。在眼科领域，LPS诱导的人视网膜色素上皮细胞（RPE)的炎症与许多视网膜疾病的病理过程相关，包括葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性（AMD)、糖尿病视网膜病变（DR)。地塞米松（DEX)是一种糖皮质激素，具有很强的抗炎和免疫抑制作用，因此被广泛用于治疗眼部炎症性疾病。但长期运用地塞米松会导致系统和局部的副作用，因此寻找新的治疗视网膜炎症的药物靶点便成为研究热点。 近年来，脂质代谢平衡与炎症的关系正成为新的研究热点。我们及其他实验室发现，脂质代谢关键受体肝脏X受体（LXRs)的外源性激动剂T0901317可抑制视网膜炎症并可能成为治疗视网膜炎症反应的一类新药。然而有报道提示内源性LXRs激动剂7-酮基胆固醇(7-KC)却能加重视网膜炎症反应。因此，我们提出疑问7-KC和 T090都是LXRs的激动剂，为什么两者在炎症调控方面却起着截然相反的作用？ 基于以上研究背景，我们将实验分为两个部分：1、验证7-KC和T090对LPS诱导的RPE细胞炎症反应具有相反作用，并采用RNA-seq和蛋白质谱关联分析研究其可能的机制。2、探讨DEX在EIU小鼠模型中的作用及其机制。 第一部分7-酮基胆固醇和T0901317在LPS诱导的视网膜色素上皮细胞炎症反应中的作用及其机制 目的： 肝脏x受体是调节脂质平衡和炎症反应的关键节点，外源性LXRs激动剂T0901317具有抑炎作用，而内源性的LXRs激动剂7-KC却起促炎作用。因此本实验旨在验证7-KC和T090对LPS诱导的炎症调控具有相反作用，并运用转录组和蛋白组学关联分析探讨其潜在机制。 方法： 不同浓度7-KC刺激人视网膜色素上皮细胞系（ARPE-19)24和36小时。然后用CCK-8和 Annexin-V FITC/PI双染色法检测ARPE-19细胞的活性和凋亡。EdU检测ARPE-19细胞的增殖。7-KC和T090作用于ARPE-19细胞12小时后，再用5μg/mL的LPS刺激ARPE-19细胞24小时。Real-time PCR检测炎症因子 IL6、IL-8和LXRs及其靶基因ABCA1、ABCG1在mRNA水平的表达。Illumina Hiseq2500平台和Q Exactive质谱仪用于转录组测序和蛋白质谱检测。 结果： 髙浓度7-KC明显降低ARPE-19细胞活性并促进凋亡。不同浓度7-KC作用ARPE-19细胞24和36小时后增殖水平无明显变化。综合细胞活性、凋亡和增殖的结果，最终选择7.5μM的7-KC作为后续研究浓度。7-KC和T090都能激活LXRs的靶基因ABCA1和ABCG1,但两者对LPS诱导的炎症反应却存在相反作用。7-KC以浓度依赖的方式上调IL-6、IL-8、LXRα、LXRβ和ABCA1、ABCG1的表达，而T090却抑制炎症反应。转录组分析提示7-KC激活了Toll-样受体和M APK等信号通路，而T090却抑制这些通路。转录组和蛋白质组联合分析发现7-KC不仅调控脂质代谢，还激活Toll-样受体、MAPK、mTOR、HIF-1和VEGF信号通路及炎症相关基因，而T090却未直接调控这些炎症通路和基因。 结论： LXRs的内源性和外源性激动剂7-KC和T090都激活其靶基因ABCA1和ABCG1，但T090起抑制炎症的作用，而7-KC却起促炎作用。这种矛盾效应可能与7-KC和T090对Toll-样受体、HIF-1、VEGF、mTOR和MAPK等炎症信号通路和脂代谢相关基因的不同调控有关。 第二部分DEX在内毒素诱导性葡萄膜炎(EIU)中的作用及其机制的研究 目的： 探讨地塞米松（DEX)对内毒素诱导性葡萄膜炎（EIU)的作用及采用转录组测序研究其潜在的机制。 方法： 在BALB/c小鼠玻璃体腔内注射125 ng内毒素（LPS)诱导EIU小鼠模型，每隔4小时用0.1%DEX滴眼，共6次。采用裂隙灯观察每个组小鼠眼前房炎症并进行临床评分，HE染色观察形态学改变。RNA测序（RNA-seq)进行转录组的研究。Real-time PCR检测炎症因子在mRNA水平的表达及验证选中的差异表达基因。 结果： DEX滴眼后显著减轻了 EIU小鼠前房和后房的炎症并降低IL-6、TNF-α、MCP-1和 ICAM-1在mRNA水平的表达。RNA-seq共检测出52个差异表达基因，与DEX+LPS组相比，在LPS组中上调的基因有37个，下调的基因有15个。差异表达基因的功能分析未发现显著富集的GO Terms, KEGG富集分析发现有6个显著上调和2个显著下调的通路。KEGG结果提示DEX治疗后可下调RIG-I类受体信号通路（Ddx58、Ifihl、Isgl5)及一些免疫炎症相关基因（Ifitl、H2-T24、Mx2和Eif2ak2)。 结论： DEX在LPS引起的EIU小鼠眼部炎症中起保护作用，此保护作用可能与下调RIG-I类受体信号通路及一些免疫炎症相关基因有关。